倪麗莉，侯振，王菁，刁飛揚(yáng)，馬翔，張燕，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210029)

正常育齡女性，自然周期卵巢規(guī)律排卵，子宮內(nèi)膜在卵巢分泌的雌孕激素作用下發(fā)生同步增長及轉(zhuǎn)化，以接受胚胎著床。了解育齡女性自然周期卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育特點(diǎn)及其影響因素對(duì)診治不孕癥十分重要。現(xiàn)實(shí)工作中，對(duì)正常育齡婦女實(shí)施大規(guī)模調(diào)查和超聲監(jiān)測存在較大困難，既往鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選擇因男方因素行自然周期供精人工授精(AID) 助孕的婦女作為研究對(duì)象，通過分析這一人群的超聲監(jiān)測數(shù)據(jù)及臨床資料，探討自然周期卵泡和子宮內(nèi)膜的發(fā)育特點(diǎn)及其影響因素，以及后續(xù)AID宮內(nèi)妊娠率的影響因素，為實(shí)施控制性促排卵(COH)治療及提高AID宮內(nèi)妊娠率提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2012年1月至2018年12月在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受AID助孕的1 200例婦女(共2 555個(gè)自然周期)的超聲監(jiān)測及臨床資料。女方年齡20～40歲，平均(28.12±3.32)歲；體重指數(shù)(BMI)15.6～34.3 kg/m2，平均(21.62±2.84)kg/m2；整體宮內(nèi)妊娠率為22.23%(568/2 555)。所有病例均符合原國家衛(wèi)生部輔助生殖技術(shù)規(guī)范中的AID指征，并按規(guī)范要求實(shí)施AID助孕。

納入標(biāo)準(zhǔn)：女方排卵功能正常，并經(jīng)輸卵管碘油造影或腹腔鏡手術(shù)證實(shí)至少排卵側(cè)輸卵管基本通暢。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體異常；(2)排卵障礙；(3)3月之內(nèi)有促排卵或中藥治療史；(4)排卵側(cè)輸卵管阻塞；(5)卵巢手術(shù)史；(6)醫(yī)源性卵巢功能下降；(7)單側(cè)卵巢；(8)影響卵泡發(fā)育的內(nèi)分泌疾病(如高泌乳素血癥、甲狀腺功能減退或亢進(jìn)、垂體或甲狀腺腫瘤)；(9)盆腔子宮內(nèi)膜易位癥、宮腔粘連史、子宮或?qū)m頸畸形患者。

按照不同因素(年齡、BMI、排卵時(shí)間、優(yōu)勢卵泡個(gè)數(shù)、是否扳機(jī))進(jìn)行分組，比較各組卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況；按照宮內(nèi)妊娠情況分為宮內(nèi)妊娠組和宮內(nèi)未妊娠組，比較兩組的女性年齡、BMI、優(yōu)勢卵泡及子宮內(nèi)膜發(fā)育情況等指標(biāo)。

二、研究方法

1. 超聲監(jiān)測：根據(jù)患者月經(jīng)周期，在預(yù)測排卵日前3～5 d開始，采用陰道超聲診斷儀(陰道探頭頻率為5.0 MHz)連續(xù)監(jiān)測卵泡發(fā)育和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況。

2. 授精時(shí)機(jī)：(1)排卵后AID：優(yōu)勢卵泡直徑達(dá)16 mm后自發(fā)排卵者，排卵當(dāng)日立即行AID。(2)排卵前AID：優(yōu)勢卵泡達(dá)18～20 mm，內(nèi)膜厚度達(dá)6 mm，給予肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，注射后約24 h行AID，48 h復(fù)查超聲明確是否排卵。未排卵者不列入本研究。

3. 精液來源和人工授精方法：所有精液來源于江蘇省人民醫(yī)院人類精子庫。使用前將凍儲(chǔ)精液取出，置入37℃電熱恒溫水浴箱復(fù)蘇10 min。精子解凍后均使用混勻離心法處理，其前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)應(yīng)≥10×106個(gè)。所有患者均行宮腔內(nèi)人工授精(IUI)。

4. 黃體支持及隨訪：超聲確認(rèn)排卵后口服地屈孕酮片(蘇威，荷蘭)10 mg或黃體酮膠丸(浙江愛生藥業(yè))100 mg，2次/d，連續(xù)13 d。第14天檢測血β-HCG，陽性者20 d后行陰道超聲檢查，宮內(nèi)發(fā)現(xiàn)孕囊者可確診為宮內(nèi)妊娠，異位妊娠屬于宮內(nèi)未妊娠。

5.觀察指標(biāo)：女方年齡、BMI、排卵時(shí)間(排卵發(fā)生于月經(jīng)周期的第幾天)、排卵前最大優(yōu)勢卵泡直徑(以下簡稱優(yōu)勢卵泡直徑)、排卵日子宮內(nèi)膜厚度、AID后宮內(nèi)妊娠率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同因素分組的患者卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況

1. 年齡：按年齡分為≤25歲、26～30歲、31～35歲、36～40歲4組。隨著年齡段的增長，排卵逐漸提早，排卵日子宮內(nèi)膜逐漸變薄，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而優(yōu)勢卵泡直徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 不同因素分組的患者卵泡及子宮內(nèi)膜發(fā)育情況(-±s)

2. BMI：按BMI的中國標(biāo)準(zhǔn)分為偏瘦(BMI<18.5 kg/m2)、正常(BMI：18.5～23.9 kg/m2)、超重(BMI：24～27.9 kg/m2)及肥胖(BMI≥28 kg/m2)4組。隨著BMI的升高，排卵日子宮內(nèi)膜逐漸增厚，前3組平均年齡逐漸增長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；而排卵時(shí)間和優(yōu)勢卵泡直徑差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

3. 排卵時(shí)間：單樣本Kolmogorov-Smirnov擬合優(yōu)度檢驗(yàn)顯示排卵時(shí)間符合正態(tài)分布(Z=6.499，P=0.000)，第10、90百分位分別為13 d、21 d。按排卵早晚分為≤12 d、13～21 d、≥22 d三組。隨著排卵時(shí)間段推遲，平均年齡逐漸減小，排卵日子宮內(nèi)膜逐漸增厚，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；優(yōu)勢卵泡直徑在數(shù)值上有縮小趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

4. 優(yōu)勢卵泡數(shù)目：按照優(yōu)勢卵泡數(shù)目分為1枚組和2枚組。本研究中98.24%(2 510/2 555)的周期發(fā)育1枚優(yōu)勢卵泡，1.76%(45/2 555)的周期發(fā)育2枚優(yōu)勢卵泡(直徑大于14 mm)。發(fā)育2枚者最大優(yōu)勢卵泡直徑顯著大于單枚者(P<0.05)；而平均年齡、排卵時(shí)間和內(nèi)膜厚度組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

5. 是否扳機(jī)：按照是否扳機(jī)分為扳機(jī)組和未扳機(jī)組。未扳機(jī)(自發(fā)排卵)組優(yōu)勢卵泡直徑顯著小于扳機(jī)組(P<0.001)；平均年齡、排卵時(shí)間及內(nèi)膜厚度組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

二、卵泡及子宮內(nèi)膜發(fā)育的相關(guān)因素

利用相關(guān)分析和偏相關(guān)分析(控制其他各種影響因素)了解優(yōu)勢卵泡直徑及排卵日子宮內(nèi)膜厚度與年齡、BMI、排卵時(shí)間、優(yōu)勢卵泡數(shù)目之間的相關(guān)性。優(yōu)勢卵泡直徑與排卵時(shí)間、優(yōu)勢卵泡數(shù)目顯著相關(guān)(P<0.05)(表2)；排卵日子宮內(nèi)膜厚度與年齡、BMI、排卵時(shí)間、最大優(yōu)勢卵泡直徑顯著相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表2 排卵前最大優(yōu)勢卵泡直徑的相關(guān)因素分析

表3 排卵日子宮內(nèi)膜厚度的相關(guān)因素分析

三、卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育參數(shù)的線性回歸分析

基于上述相關(guān)性，利用多元線性回歸分析建立各參數(shù)之間的線性方程。BMI=20.011+0.057×年齡(歲)(模型R2=0.005，F(xiàn)=11.557，P=0.001)，每增長1歲，BMI約增加0.057 kg/m2(P=0.001)。排卵時(shí)間=18.368-0.111×年齡(歲)+0.050×BMI(kg/m2)(模型R2=0.014，F(xiàn)=18.302，P=1.28E-8)，每增長1歲，排卵提早0.111 d(P=8.87E-9)；BMI每增加1 kg/m2，排卵推后0.05 d(P=0.028)。排卵前最大優(yōu)勢卵泡直徑=19.064+0.443×優(yōu)勢卵泡數(shù)目(個(gè))-0.026×排卵時(shí)間(d)(模型R2=0.007，F(xiàn)=8.636，P=1.83E-4)；發(fā)育2枚優(yōu)勢卵泡者，最大卵泡直徑較單枚優(yōu)勢卵泡者增大0.443 mm(P=0.021)；排卵每推后1 d，優(yōu)勢卵泡直徑縮小0.026 mm(P=0.001)。排卵日子宮內(nèi)膜厚度=7.289-0.037×年齡(歲)+0.050×BMI(kg/m2)+0.098×排卵時(shí)間(d)+0.074×排卵前最大優(yōu)勢卵泡直徑(mm)(模型R2=0.039，F(xiàn)=25.798，P=5.46E-21)，每增長1歲，排卵日子宮內(nèi)膜厚度減少0.037 mm(P=0.002)；BMI每增加1 kg/m2，內(nèi)膜增厚0.050 mm(P=2.41E-4)；排卵每延遲1 d，內(nèi)膜增厚0.098 mm(P=2.02E-16)；優(yōu)勢卵泡直徑每增加1 mm，內(nèi)膜增厚0.074 mm(P=0.014)(圖1)。

四、AID宮內(nèi)妊娠組與未妊娠組各項(xiàng)參數(shù)比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與宮內(nèi)未妊娠組比較，宮內(nèi)妊娠組女方平均年齡顯著降低(P<0.05)，周期序號(hào)平均值顯著下降(P<0.05)，排卵日子宮內(nèi)膜厚度顯著增加(P<0.05)。而BMI、排卵時(shí)間、優(yōu)勢卵泡直徑及數(shù)目、排卵日子宮內(nèi)膜三種分型(A型、B型、C型)比例、既往有妊娠史者占比、排卵側(cè)輸卵管通而欠暢者占比等組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

注：箭頭表示自變量與因變量之間存在顯著的線性相關(guān)；B：經(jīng)多元線性回歸分析所得的偏回歸系數(shù)。圖1 影響卵泡和子宮內(nèi)膜厚度各參數(shù)之間線性相關(guān)的模式圖

表4 AID宮內(nèi)妊娠組與宮內(nèi)未妊娠組各參數(shù)比較[(-±s)，%]

五、AID宮內(nèi)妊娠的Logistic回歸分析

以表4內(nèi)差異顯著的參數(shù)(年齡、周期序號(hào)、排卵日子宮內(nèi)膜厚度)及臨床上可能影響AID結(jié)局的因素(BMI、優(yōu)勢卵泡直徑、數(shù)目、排卵時(shí)間、輸卵管是否通而欠暢)為自變量，以AID助孕后宮內(nèi)是否妊娠為因變量行Logistic回歸分析(逐步向前法)。結(jié)果顯示年齡、治療周期數(shù)、排卵日子宮內(nèi)膜厚度與AID后宮內(nèi)妊娠率顯著相關(guān)。每增長1歲，AID宮內(nèi)妊娠率下降3.4%(OR=0.966，P=0.020)；每增加1個(gè)治療周期，周期宮內(nèi)妊娠率下降10.9%(OR=0.891，P=0.037)；排卵日子宮內(nèi)膜每增厚1 mm，宮內(nèi)妊娠率升高5.8%(OR=1.058，P=0.019)；其余參數(shù)對(duì)AID宮內(nèi)妊娠率無顯著影響(表5)。

結(jié)果顯示，排卵日子宮內(nèi)膜厚度是AID宮內(nèi)妊娠最有力的預(yù)測因子。將研究人群按內(nèi)膜厚度分段(段距為1 mm)分組比較，當(dāng)內(nèi)膜厚度從<6.0 mm增至8.0～8.9 mm，AID宮內(nèi)妊娠率從0直線升高至22.5%，8.0～14.9 mm的內(nèi)膜厚度對(duì)應(yīng)的AID宮內(nèi)妊娠率在21.5%～25.0%之間波動(dòng)，近似平臺(tái)期；內(nèi)膜達(dá)15.0 mm后妊娠率繼續(xù)升高達(dá)28.6%；內(nèi)膜達(dá)16.0 mm以上時(shí)宮內(nèi)妊娠率出現(xiàn)第二個(gè)平臺(tái)期(33.3%)；由于內(nèi)膜16.0 mm以上的周期數(shù)較少，故兩個(gè)平臺(tái)期的宮內(nèi)妊娠率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

表5 AID周期宮內(nèi)妊娠率的多因素Logistic回歸分析(逐步向前法)

圖2 AID宮內(nèi)妊娠率與排卵日子宮內(nèi)膜厚度的關(guān)系

討 論

卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育狀況是超聲可監(jiān)測的影響受孕的關(guān)鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)排卵時(shí)間與年齡呈線性負(fù)相關(guān)，與BMI呈線性正相關(guān)。隨年齡增長女性體內(nèi)抗苗勒管激素(AMH)水平下降，加速了竇卵泡募集和發(fā)育[1-2]，卵泡期縮短，且卵巢功能下降使黃體期募集優(yōu)勢卵泡的概率增加[3]，故排卵日逐漸提前；卵泡期體內(nèi)FSH濃度隨體重增加而下降，故BMI越高者FSH濃度越低，卵泡發(fā)育速度可能因此減慢，排卵越遲。自然周期發(fā)育兩枚優(yōu)勢卵泡者，最大優(yōu)勢卵泡直徑較單枚優(yōu)勢卵泡者大0.443 mm。既往并無相關(guān)研究，推測原因可能是前者早卵泡期體內(nèi)FSH濃度較高，促進(jìn)優(yōu)勢卵泡發(fā)育較大，但具體還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

子宮內(nèi)膜充分增生并向分泌期轉(zhuǎn)化是胚胎著床的必要條件。在無法得到內(nèi)膜病理的情況下，子宮內(nèi)膜厚度是其增生程度的反映。本研究中排卵日子宮內(nèi)膜厚度與年齡呈線性負(fù)相關(guān)。隨年齡增長，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中雌激素受體減少，內(nèi)膜及內(nèi)膜下血管化水平降低[4]、內(nèi)膜血流量下降[5]，同時(shí)HOXA10等基因表達(dá)水平明顯下降[6]，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜增厚及其容受性。子宮內(nèi)膜厚度與BMI呈線性正相關(guān)，這與既往文獻(xiàn)[7-9]結(jié)論一致。子宮內(nèi)膜增厚、過度增生甚至癌變都與高雌激素作用有關(guān)[10]。因脂肪細(xì)胞可將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，肥胖者被視為高雌激素狀態(tài)，故肥胖被公認(rèn)為子宮內(nèi)膜過度增殖甚至癌變的一大危險(xiǎn)因素[11]。因此，為提高妊娠率并預(yù)防子宮內(nèi)膜過度增殖，將女性BMI控制在正常范圍尤為重要。此外，內(nèi)膜厚度與排卵時(shí)間、最大優(yōu)勢卵泡直徑都呈線性正相關(guān)。說明子宮內(nèi)膜不但隨著優(yōu)勢卵泡增大、雌激素水平升高而增厚，同時(shí)也受雌激素作用時(shí)間——卵泡期長短的正面影響。

以往大量研究證實(shí)HCG日、取卵日及胚胎移植日的子宮內(nèi)膜厚度都與IVF臨床妊娠率成正比[12-14]。本文利用Logistic回歸分析證實(shí)排卵日子宮內(nèi)膜厚度是AID宮內(nèi)妊娠最顯著的預(yù)測因子，這與既往的文獻(xiàn)[7-8，15]結(jié)論一致。本研究中，當(dāng)排卵日子宮內(nèi)膜厚度為9 mm以下時(shí)，宮內(nèi)妊娠率隨排卵日子宮內(nèi)膜增厚呈直線增長，說明這一范圍內(nèi)尋找靶向治療方法增厚子宮內(nèi)膜對(duì)提高AID宮內(nèi)妊娠率最具臨床價(jià)值。內(nèi)膜過厚是否會(huì)干擾胚胎著床而降低妊娠率，目前仍有爭議[16]。本研究中隨排卵日子宮內(nèi)膜增厚，AID宮內(nèi)妊娠率未出現(xiàn)明顯下降。由于內(nèi)膜未達(dá)6 mm的患者僅2例，故暫無法得出內(nèi)膜厚度6 mm以下者AID后不可能宮內(nèi)受孕的結(jié)論。

隨年齡增長，卵泡內(nèi)環(huán)境[17]、卵母細(xì)胞質(zhì)量[18]、受精率、胚胎質(zhì)量都逐漸下降，后續(xù)著床及宮內(nèi)繼續(xù)發(fā)育的能力也隨之下降，故年齡本身是AID宮內(nèi)妊娠率的獨(dú)立負(fù)面影響因子[19]。既往研究普遍認(rèn)為女方年齡與IUI或AID臨床妊娠率顯著負(fù)相關(guān)[20-23]。僅有少量文獻(xiàn)的結(jié)論例外，但因?yàn)檫@些文獻(xiàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)都為不明原因不孕患者，即使年輕患者也可能因潛在的不孕因素影響受孕，故而干擾了年齡對(duì)妊娠率的影響力[8，24]。另一方面年齡增長對(duì)排卵日子宮內(nèi)膜厚度呈負(fù)面影響，間接降低了AID宮內(nèi)妊娠率，這也是女性年齡與生育力呈負(fù)相關(guān)的另一重要原因。

治療周期數(shù)是AID宮內(nèi)妊娠率的另一負(fù)面影響因子。這與既往多個(gè)研究結(jié)論一致。Dickey等[25]發(fā)現(xiàn)隨著治療周期數(shù)增加，IUI周期妊娠率逐漸下降；第5、6周期的妊娠率下降至2.8%，第6周期以后，再無成功受孕者。Esmailzadeh等[15]學(xué)者同樣利用多因素Logistic回歸分析證實(shí)治療周期數(shù)是IUI妊娠率最有力的預(yù)測因子。推測原因可能是某些患者因潛在的不孕因素(AID技術(shù)無法解決或改善)周期成功率較低，隨著治療周期數(shù)增加，該類患者所占比例逐漸升高，故周期成功率逐漸下降。

自然周期優(yōu)勢卵泡大小及數(shù)目對(duì)AID宮內(nèi)妊娠率均無顯著影響。由于最大卵泡直徑小于16 mm而自發(fā)排卵者已取消周期未納入統(tǒng)計(jì)，而卵泡直徑達(dá)20 mm時(shí)予及時(shí)扳機(jī)，故本研究中最大優(yōu)勢卵泡直徑集中在16～22 mm。說明這一范圍內(nèi)的優(yōu)勢卵泡大小對(duì)AID宮內(nèi)妊娠率并無顯著影響。自然周期優(yōu)勢選擇作用和較大優(yōu)勢卵泡排卵前LH峰常常影響第2枚優(yōu)勢卵泡的發(fā)育。在發(fā)育2枚優(yōu)勢卵泡的周期中，第2枚優(yōu)勢卵泡直徑小于16 mm者占58%(26/45)?？赡芤虼讼魅趿藘?yōu)勢卵泡數(shù)目對(duì)AID宮內(nèi)妊娠率的正面影響。

本研究通過監(jiān)測自然周期行AID助孕女性的卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，利用分組比較、相關(guān)分析及多元線性回歸分析逐步證實(shí)年齡和BMI都顯著影響著自然周期卵泡和子宮內(nèi)膜的發(fā)育。多因素Logistic回歸分析證實(shí)排卵日子宮內(nèi)膜厚度、女方年齡、治療周期數(shù)是自然周期AID宮內(nèi)妊娠率的顯著影響因子。為提高AID助孕效果，應(yīng)將女方BMI控制在正常范圍，趁年輕盡早助孕，并積極尋找靶向治療方法優(yōu)化子宮內(nèi)膜。