王麗平，陳雪芬，趙茂，李學(xué)任，劉斌△，彭守春△

單核細胞因具有吞噬和產(chǎn)生細胞因子、促進膠原合成以及血管生成等作用，從而在炎癥及免疫反應(yīng)中扮演重要角色。2010年國際單核細胞/樹突細胞命名委員會根據(jù)細胞表面CD14和CD16的表達情況，將人類循環(huán)中的單核細胞分為經(jīng)典型（CD14++CD16-，Mon1）、中間型（CD14++CD16+，Mon2）和非經(jīng)典型（CD14+CD16++，Mon3）3 個亞群［1］。在疾病狀態(tài)下，單核細胞亞群的分化及功能狀態(tài)發(fā)生改變從而參與疾病的發(fā)展過程，例如循環(huán)中的CD16+單核細胞增加［2-3］，并與不良臨床預(yù)后有關(guān)［4-5］。

與單核細胞相似，巨噬細胞具有較強的異質(zhì)性，隨周圍環(huán)境的變化發(fā)生亞群的偏移和功能狀態(tài)的改變［6］。目前巨噬細胞可分為M1型和M2型，其中M2型巨噬細胞在纖維化期促進細胞外基質(zhì)沉積、瘢痕形成中發(fā)揮重要作用，與多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，在炎癥條件下，Ly-6Clow單核細胞可能是肺巨噬細胞的前體細胞［7］。本課題組前期研究證實，在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，單核巨噬細胞亞群均呈現(xiàn)動態(tài)變化［8］，與間質(zhì)性肺病（interstitial lung disease，ILD）的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。而目前單核巨噬細胞亞群在結(jié)締組織病相關(guān)肺間質(zhì)病變（connective tissue associated interstitial lung disease，CTD-ILD）中的表達情況尚不清楚。本研究通過對CTD-ILD患者、單純CTD（CTD-nILD）患者、健康體檢者循環(huán)單核細胞亞群及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中巨噬細胞亞群的測定，進一步探討不同單核巨噬細胞亞群在CTD-ILD 中的表達水平，為下一步探討單核巨噬細胞不同亞群在CTD-ILD發(fā)病中的作用打下基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集于2017年7月—2018年2月在中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學(xué)中心呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科住院的CTD 患者 77 例，其中男 21 例，女 56 例，年齡 30～83 歲，平均（60.17±12.78）歲。將患者分為單純CTD組（CTD-nILD組）30例和CTD 合并ILD 組（CTD-ILD 組）47 例。同時選取年齡及性別相仿的健康體檢者30例作為健康對照組（NC組）。3組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。將CTD-ILD 組中行支氣管鏡檢查的患者作為試驗組，選取不明原因咳嗽或胸悶、且支氣管肺泡灌洗液細胞學(xué)常規(guī)檢查無異常的患者作為對照組。該組患者行支氣管鏡檢查的目的在于排除支氣管疾病以明確診斷。收集2 組患者的BALF 檢測巨噬細胞亞群，其中試驗組25例，男10例，女15例，平均年齡（59.44±10.74）歲。對照組20 例，男8 例，女12 例，平均年齡（44.90±9.04）歲。本研究通過本院倫理委員會審查同意，所有患者均簽署知情同意書。

Tab.1 Comparison of the general data between three groups表1 各組研究對象一般資料比較

1.2 診斷、納入與排除標準 診斷標準：所選病例應(yīng)符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）診斷標準、2012年系統(tǒng)性紅斑狼瘡國際臨床協(xié)作組（SLICC）修訂的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）分類標準、1975年Bohan 提出的多發(fā)性肌炎/皮肌炎（PM/DM）診斷標準、2002年干燥綜合征（SS）國際診斷標準、2013年ACR/EULAR 系統(tǒng)性硬化癥（SSc）分類標準、1999年Danieli 提出的未分化結(jié)締組織病（UCTD）的診斷標準以及1987年Sharp提出的混合型結(jié)締組織?。∕CTD）的診斷標準。本研究中，CTD-ILD 組中 RA 患者 17 例，SLE 患者 1 例，PM/DM 患者 9 例，SS 患者 8 例，SSc 患者 5 例，UCTD 患者 3 例，MCTD 患者 4 例；CTD-nILD 組中 RA 患者 14 例，SLE 患者 4例，PM/DM患者1例，SS患者4例，SSc患者2例，UCTD患者3例，MCTD患者2例。

納入標準：年齡18～70 歲，入選患者均無糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑使用史，或已停用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑半年以上。排除標準：（1）除外環(huán)境因素、職業(yè)因素、藥物因素及感染因素等其他原因?qū)е碌腎LD。（2）合并有惡性腫瘤、感染、肺靜脈閉塞，慢性阻塞性肺疾病等。（3）妊娠及哺乳期婦女。（4）職業(yè)、藥物、遺傳、環(huán)境因素引起的肺部病變，家族性特發(fā)性肺纖維化。（5）嚴重臟器功能不全如肺動脈高壓，先天性心臟病，左心功能衰竭等。（6）近期發(fā)生肺部感染者。

1.3 方法

1.3.1 一般臨床資料的收集 收集入組患者的性別、年齡、胸部高分辨率CT（High resolution CT，HRCT）檢查、肺功能檢查［包括用力肺活量（FVC）、一氧化碳彌散量（TLCO）］等臨床資料。

1.3.2 主要試劑與儀器 流式細胞術(shù)檢測單核細胞亞群所用抗CD14-FITC、抗CD16-PE、抗CD86-PE-Cy5及抗CD41-PE-Cy7 抗體均購自美國Biolegend 公司，流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞亞群所用抗CD11b-FITC、抗CD169-PE、抗CD206-PE-Cy5、抗CD163-PE-Cy7 抗體均購自美國Biolegend 公司。流式細胞儀Cytomics FC 500 購自美國Beckman-Coulter 公司，肺功能儀購自德國Master Screen Diffusion公司，電子支氣管鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.3.3 外周血單核細胞亞群檢測方法 所有患者入院后24 h 內(nèi)采取晨起空腹外周靜脈血2 mL，血液樣本在采血后2 h內(nèi)須完成單核細胞亞群流式細胞術(shù)分析。取新鮮EDTA抗凝全血標本 50 μL 加入 10 μL 抗人CD14、10 μL 抗人CD16、10 μL抗人CD86、10 μL抗人CD41進行抗體標記。室溫避光條件下孵育15 min 后加1 mL 紅細胞裂解液，渦旋混勻后孵育10 min，上機檢測。根據(jù)CD14和CD16的熒光強度不同劃分為Mon1、Mon2 和Mon3 亞群。流式結(jié)果的分析采用FlowJo 7.6軟件。

1.3.4 BALF 巨噬細胞亞群檢測方法 新鮮BALF 100 μL加入20 μL CD11b、CD169、CD206 熒光抗體混勻孵育20 min，300×g離心5 min 棄上清；加1∶9配制的溶血素2 mL，避光10 min，200×g離心5 min棄上清液；加入PBS緩沖液，300×g離心5 min 棄上清，加0.5 mL PBS 重懸細胞，上機待測。根據(jù)CD163+/CD163++的表達情況分析巨噬細胞亞型比例。流式結(jié)果分析采用FlowJo 7.6軟件。

1.3.5 ILD 患者的HRCT 表現(xiàn) 由1 位放射科醫(yī)師和2 位呼吸科醫(yī)師分別對胸部HRCT的病變范圍進行評估，取主動脈弓上緣、隆突、膈肌上1 cm 水平，分別計算3 個層面纖維化（蜂窩影和網(wǎng)格影）和磨玻璃影占相應(yīng)肺野面積的百分比。當(dāng)受累面積為0 時為0 分，1%～25%時計1 分，26%～50%計2分，51%～75%計3 分，76%～100%計4 分，將評分相加即為相應(yīng)評分。

1.3.6 肺功能檢查 用鼻夾將患者鼻子夾住，盡可能含緊一次性口含嘴，患者平靜呼吸4～5 個循環(huán)，待潮氣末基線平穩(wěn)后，讓患者快速呼氣至殘氣量位；然后快速均勻吸氣至肺總量位；接著屏氣10 s，最后在2～4 s內(nèi)用力將全部氣體均勻呼出至殘氣量位；再做1次平靜呼吸，記錄FVC和TLCO。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組組間比較采用單因素方差分析，經(jīng)方差齊性檢驗，方差齊時采用LSD-t法進行組間多重比較；方差不齊時用Dunnett's T3法進行組間多重比較。正態(tài)分布的連續(xù)型變量資料之間采用Pearson 檢驗行相關(guān)性分析，非正態(tài)分布的連續(xù)型變量資料之間采用Spearman 檢驗行相關(guān)性分析。以雙側(cè)α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 循環(huán)單核細胞亞群比例檢測結(jié)果 CTD-nILD組和 CTD-ILD 組 Mon1 亞群比例低于 NC 組（P＜0.05），CTD-nILD 組與 CTD-ILD 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CTD-nILD組和CTD-ILD組Mon2亞群比例均明顯高于NC 組，CTD-ILD 組高于CTD-nILD 組（P＜0.05）；Mon3 亞群比例在 NC 組、CTD-nILD 組和CTD-ILD 組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

Tab.2 Monocyte subsets detected by flow cytometry in three groups表2 流式細胞術(shù)檢測各組循環(huán)單核細胞亞群比例分布情況

2.2 CTD-ILD 組單核細胞亞群水平與HRCT 評分的相關(guān)性分析 47 例CTD-ILD 患者均完成HRCT檢查，Pearson 相關(guān)分析顯示，Mon2 亞群比例與HRCT磨玻璃影評分呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

Tab.3 Correlation of the percentage of monocyte subsets with HRCT scores in the CTD-ILD group表3 CTD-ILD組單核細胞亞群比例與HRCT評分的相關(guān)性分析

2.3 CTD-ILD 組循環(huán)單核細胞亞群水平與肺功能指標的相關(guān)性分析 CTD-ILD 組共有36 例患者行肺功能檢查，其中29例完成彌散功能檢查。Pearson相關(guān)分析顯示，單核細胞3 個亞群比例與肺功能指標均無線性相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05）。見表4。

2.4 BALF 巨噬細胞亞群比例檢測結(jié)果 試驗組M1 比例明顯低于對照組，M2 比例高于對照組（P＜0.05），見表5。25例試驗組患者均完成HRCT檢查，Pearson 相關(guān)分析顯示，巨噬細胞亞群比例與HRCT評分均無明顯相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05），見表6。試驗組患者均行肺功能檢查，Pearson 相關(guān)分析顯示，M2巨噬細胞與肺功能指標均無線性相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05），見表7。

Tab.4 Correlation of the percentage of monocyte subsets with pulmonary function test index in the CTD-ILD group表4 CTD-ILD組單核細胞亞群比例與肺功能指標的相關(guān)性分析

Tab.5 Macrophage subsets detected by flow cytometry in the two groups表5 試驗組和對照組BALF巨噬細胞亞群比例分布情況

Tab.6 Correlation of the percentage of monocyte subsets with HRCT scores in the CTD-ILD group表6 試驗組巨噬細胞亞群比例與HRCT評分的相關(guān)性分析

Tab.7 Correlation of the percentage of macrophage subsets with pulmonary function test index in the experimental group表7 試驗組巨噬細胞亞群比例與肺功能指標的相關(guān)性分析

2.5 Mon2 單核細胞亞群與M2 巨噬細胞亞群的相關(guān)性分析 將CTD-ILD 組巨噬細胞亞群比例與相對應(yīng)的外周血單核細胞亞群比例進行相關(guān)分析顯示，單核細胞亞群分化和巨噬細胞亞群分化之間無明顯線性相關(guān)關(guān)系（均P＞0.05），見表8。

Tab.8 Correlation of the percentage of monocyte subsets with the percentage of macrophage subsets in the CTD-ILD group表8 CTD-ILD組單核細胞亞群比例與巨噬細胞亞群比例的相關(guān)性分析

3 討論

在正常人體內(nèi)，CD14++CD16-單核細胞群約占單核細胞的90%，CD16+單核細胞群約占10%，其進一步分為CD14++CD16+亞群和CD14+CD16++亞群［1］。研究表明，Mon2單核細胞比例升高可能與一些炎癥性疾病或纖維化疾病的發(fā)病機制相關(guān)，如RA［9］和肝纖維化［10］。另有研究指出Mon1和Mon2單核細胞比例的升高與特發(fā)性肺纖維化（IPF）進展相關(guān)，尤其是Mon2 單核細胞比例的升高提示IPF 患者預(yù)后更差［11］。可見，單核細胞向Mon2亞群偏移可產(chǎn)生更強的促炎作用，與ILD 的發(fā)生有密切關(guān)系。同時多項研究表明，巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化可能參與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展［12］，在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，M2型巨噬細胞在第14天左右達峰值，并且與肺纖維化的程度呈現(xiàn)明顯正相關(guān)［13］。本研究結(jié)果顯示，CTD-ILD患者的外周血Mon2單核細胞亞群比例以及BALF 中M2巨噬細胞亞群比例均明顯升高，提示二者在CTD-ILD 的不同病理階段可能發(fā)揮一定的促進作用。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，Mon2單核細胞可分泌促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β等，從而在疾病狀態(tài)中發(fā)揮更強的促炎作用［14］。同時Mon2 亞群已經(jīng)被證明可以通過表達血管內(nèi)皮生長因子促進肌成纖維細胞分化，增加膠原沉積［7］。因此，Mon2 單核細胞比例的升高與一些炎癥性疾病/纖維化疾病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與NC 組相比，CTD-nILD 組與 CTD-ILD 組患者 Mon2 單核細胞比例均升高，其中CTD-ILD 患者Mon2 比例升高更顯著。進一步分析發(fā)現(xiàn)在CTD-ILD患者中，Mon2水平與HRCT的磨玻璃影評分呈正相關(guān)，提示Mon2可能在ILD早期炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮更重要的作用。但是未發(fā)現(xiàn)單核細胞與肺功能指標之間的關(guān)系，可能與樣本量較小或者單核細胞檢測與肺功能檢測不是同時期完成有關(guān)。

本課題組前期結(jié)果顯示，博萊霉素誘導(dǎo)的肺損傷小鼠從炎癥期到損傷修復(fù)期，BALF 中M1 巨噬細胞逐漸減少，M2型巨噬細胞逐漸增多［13］。在IPF患者和SSc-ILD 患者中，M2 型巨噬細胞表面標志物CCL-18 明顯增高，同時與肺纖維化程度呈正相關(guān)［15］。本研究結(jié)果顯示，試驗組M2比例明顯高于對照組，說明在CTD-ILD 患者中巨噬細胞有向M2 亞群偏移的傾向，與以往研究結(jié)果一致。但是本研究并未發(fā)現(xiàn)M2 巨噬細胞比例與纖維化評分之間的相關(guān)關(guān)系，應(yīng)當(dāng)注意到二者呈正相關(guān)且相關(guān)系數(shù)較大。下一步應(yīng)該進一步擴大樣本量，并且優(yōu)化檢測方法進一步驗證。

Lescoat 等［16］研究顯示，CD16+單核細胞不僅與SSc患者肺纖維化嚴重程度和DLCO的減少有關(guān)，而且還被認為是M2巨噬細胞的前體。由此猜測，CTD患者外周血CD16+單核細胞的增加很有可能導(dǎo)致M2型巨噬細胞增多，從而在ILD的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［17］。但是本研究中未發(fā)現(xiàn)CD16+單核細胞與M2巨噬細胞之間存在相關(guān)性，下一步應(yīng)擴大樣本量進一步觀察單核巨噬細胞在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的相互關(guān)系。

綜上所述，Mon2 單核細胞和M2 巨噬細胞在CTD-ILD 中均顯著增高，提示Mon2 單核細胞和M2型巨噬細胞在ILD 的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。尤其是Mon2與HRCT磨玻璃影評分呈正相關(guān)，提示Mon2單核細胞可能在評價病情方面發(fā)揮一定作用，為進一步研究單核巨噬細胞亞群在CTD-ILD 發(fā)病機制中的作用提供參考。