李玉玲，劉曉力，許娜，唐加明，陸紫媛△

細胞周期性激酶抑制因子A（CDKN2A）位于9p21.3 區(qū)域，是重要的抑癌基因，其編碼p16（INK4a）和p14（ARF）兩種周期抑制蛋白。其中p16通過抑制CDK4/6-cyclinD 復(fù)合物激酶活性，使視網(wǎng)膜母細胞瘤（Rb）蛋白呈持續(xù)高磷酸化的活化狀態(tài)，從而抑制細胞由G1期進入到S期，導(dǎo)致細胞周期停滯［1］。目前已在食管鱗狀細胞癌、肝癌、膀胱癌等惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)p16基因缺失，p16基因缺失同時也是急性B淋巴細胞白血?。˙-ALL）中最常見的拷貝數(shù)改變（CNAS）［2］。有研究證實p16基因缺失是B-ALL的獨立不良預(yù)后因素［3］，p16基因缺失影響費城染色體（Ph）陽性B-ALL對酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的治療敏感性，使Ph陽性B-ALL患者的預(yù)后變差［4］。Ph陰性B-ALL 與Ph 陽性B-ALL 具有很大的異質(zhì)性，但目前尚少見p16 基因缺失對成人Ph 陰性B-ALL患者預(yù)后影響的相關(guān)報道。本研究通過大樣本量分析p16 基因缺失的成人Ph 陰性B-ALL 患者的臨床特征、免疫分型特點及預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年1月—2018年6月在廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院血液內(nèi)科確診為Ph陰性的B-ALL患者。納入標準：（1）初診時行骨髓細胞形態(tài)學、細胞化學、免疫分型、細胞遺傳學檢查確診為急性B-ALL患者。（2）細胞遺傳學檢查為Ph陰性。排除標準：（1）未接受規(guī)律治療者。（2）中途失訪者。（3）由于個人原因未行所有檢查者。按上述標準最終納入210例患者（廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院78例，南方醫(yī)院132例）為研究對象，其中男125 例，女85 例，年齡 18～63 歲，中位年齡為 32.5 歲。根據(jù)初發(fā)時檢測的p16基因狀態(tài)分為p16基因缺失組（61例）和無缺失組（149例）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 查閱患者初次診斷時血常規(guī)、肝脾B超結(jié)果，收集血常規(guī)中白細胞計數(shù)（WBC）及B超中肝脾腫大情況、骨髓細胞形態(tài)學結(jié)果中的骨髓原始細胞比例、免疫分型、細胞遺傳學等臨床資料。

1.2.2 免疫分型檢測 采用直接免疫熒光法，3 種熒光抗體熒光素異硫氰酸熒光素（FITC）/紅蛋白（PE）/多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）、紅細胞裂解液、鞘液（PBS）均購自美國Bection Dickinson 公司，使用FACSCantoⅡ流式細胞儀（480 nm 氬離子為激發(fā)光源，美國Bection Dickinson公司）進行檢測。所檢測抗原包括：白細胞抗原34（CD34）、人白細胞分化抗原DR（HLA-DR）、CD45、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶抗原（TdT）、CD117、CD10、CD19、CD20、CD22、CD13、CD14、CD15、CD33、CD2、CD3、CD7、CD56、CD64、CD11b、胞漿髓過氧化物酶抗原（cMPO）及白細胞胞漿抗原79a（cCD79a）。取肝素抗凝的白血病患者骨髓血2 mL，對每一份標本設(shè)對照管和試驗管。分別加入肝素抗凝全血100 μL，3種熒光標記抗體各20 μL，室溫避光孵育約15 min，再加入2 mL 紅細胞裂解液，震蕩后置室溫10 min，離心后棄上清，用PBS 洗滌2 次，加入15 mL PBS，上機待檢。所有結(jié)果分析均參照白血病分型歐洲組標準（EGIL）［5］。

1.2.3 多探針熒光原位雜交（FISH） 采集患者新鮮的骨髓細胞，用間期熒光原位雜交技術(shù)檢測p16基因缺失、E2A與前B細胞白血病轉(zhuǎn)錄因子1（E2A-PBXl）融合基因、混合系白血?。∕LL）斷裂基因、E26 白血病轉(zhuǎn)錄因子與急性髓系白血病基因1（TEL-AMLl）融合基因、前癌基因c-ABL與斷裂點簇集區(qū)BCR（BCR-ABL）融合基因、多倍體檢測、MYC斷裂基因及IGH 斷裂基因，8 個探針按設(shè)計組合標記固定于一張檢測玻片，按試劑盒（英國Cytocell）操作說明進行操作。所有結(jié)果的分析均采用人類細胞遺傳學國際命名體制（ISCN）2009 標準［6］，每份間期核標本計數(shù)200 個細胞。針對p16 缺失的探針組包括：覆蓋9p21 區(qū)域101 kb 的紅色探針，9 號染色體質(zhì)控探針（綠色）。正常細胞的熒光原位雜交信號為2紅2綠，1紅2 綠表明p16 基因從1 條染色體中缺失，即雜合性缺失，0紅2綠為純合性缺失，雜合性缺失與純合性缺失均定義為缺失，見圖1。

Fig.1 The p16 gene deletion detected by fluorescence in situ hybridization圖1 間期熒光原位分析p16基因缺失

1.2.4 危險分組、治療方案及療效評估 根據(jù)2014NCCN 指南［7］，具有以下任一危險因素均定義為高危患者：（1）Ph陽性或BCR-ABL 基因陽性；（2）MLL 基因重排；（3）初診時WBC≥30×109/L；（4）低二倍體數(shù)（染色體數(shù)＜44 條）。其余則為標危組。210 例患者初次確診后住院接受規(guī)律治療，首先予標準的VILP（長春新堿、去甲氧柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松）或VDLP（長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松）方案進行誘導(dǎo)緩解，緩解后予Hyper CVAD A（環(huán)磷酰胺、長春新堿、阿霉素、地塞米松）和Hyper CVAD B（大劑量甲氨蝶呤和阿糖胞苷）方案交替進行鞏固治療，所有患者均行腰椎穿刺并前鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。97 例患者在鞏固2～5個療程后接受異基因造血干細胞移植，治療方案詳見參考文獻［4］，其余患者因經(jīng)濟、無合適供者或并發(fā)癥等原因只行單純化療。

療效評估：完全緩解（CR）定義為化療后患者骨髓中原始細胞≤0.050，外周血中性粒細胞≥1.5×109/L，血小板計數(shù)（PLT）≥100×109/L，白細胞分類中無白血病細胞，且無髓外白血病。復(fù)發(fā)定義為獲得完全緩解患者骨髓中原始細胞≥0.050或者發(fā)生髓外侵犯。

1.2.5 隨訪 對患者從確診后每3 個月進行1 次電話隨訪，隨訪截止日期為2018年12月31 日。總生存時間（OS）定義為初次確診日期至死亡日期或末次隨訪日。無病生存時間（DFS）定義為CR 至白血病復(fù)發(fā)或在CR 期間死亡或末次隨訪日。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 17.0 進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料組間比較采用Pearsonχ2檢驗、校正χ2檢驗或Fisher 確切概率法。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，并采用Log-rank 檢驗比較生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p16基因缺失與無缺失患者的臨床基本特征比較 p16基因缺失組與無缺失組間性別、年齡、初診時WBC、骨髓中原始細胞比例、肝脾腫大及高危患者比例差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 p16基因缺失與無缺失患者免疫表型及細胞遺傳學比較 210例患者中有75例（35.7%）CD20抗原表達陽性（CD20抗原表達＞20%），其中p16基因缺失組中伴CD20 表達者所占比例明顯高于無缺失組（P＜0.05），2 組患者間其余免疫表型分布差異無統(tǒng)計學意義，見表2。p16基因缺失組與無缺失組間細胞遺傳學分布差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.3 p16 基因缺失與無缺失患者的療效及預(yù)后比較 （1）療效。p16 基因缺失組造血干細胞移植率和完全緩解率與無缺失組差異均無統(tǒng)計學意義，復(fù)發(fā)率明顯高于無缺失組（χ2=12.027，P＜0.05），見表4。79 例復(fù)發(fā)患者中，4 例患者初發(fā)時未檢測出p16基因缺失，而復(fù)發(fā)時檢測出p16基因缺失，復(fù)發(fā)患者p16 基因缺失率明顯高于初發(fā)患者（χ2=9.254，P=0.002）。（2）預(yù)后。對210例患者進行隨訪，中位隨訪時間為30（1～87）個月，p16 基因缺失組（61 例）中位OS和中位DFS分別為23個月和15個月，p16基因無缺失組（149 例）中位OS 和中位DFS 分別為40 個月和38個月，p16基因無缺失組患者OS和DFS明顯優(yōu)于 p16 基因缺失組（Log-rankχ2分別為 16.715、21.237，P＜0.05），見圖2、3。p16基因缺失組中接受造血干細胞移植患者中位OS 及中位DFS 分別為38個月和27 個月，接受化療患者中位OS 及中位DFS分別為17個月和10個月，接受造血干細胞移植患者的OS和DFS明顯優(yōu)于接受化療者（Log-rankχ2分別為25.316、20.637，P＜0.05），見圖4、5。

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups of patients表1 伴p16基因缺失組與無缺失組患者臨床特征的比較

Tab.2 Comparison of the immunophenotypes between two groups of patients表2 伴p16基因缺失與無缺失急性ph陰性B-ALL患者免疫表型的比較 ［例（%）］

Tab.3 Comparison of cytogenetics between two groups of patients表3 伴p16基因缺失與無缺失急性ph陰性B-ALL患者細胞遺傳學的比較 ［例（%）］

Tab.4 Comparison of the therapeutic efficacy between two groups of patients表4 伴p16基因缺失與不伴p16基因缺失急性ph陰性B-ALL患者治療療效的比較 ［例（%）］

Fig.2 Kaplan-Meier survival curves for overall survival in two groups of patients圖2 p16基因缺失組與無缺失組患者OS比較

Fig.3 Kaplan-Meier survival curves for disease free survival in two groups of patients圖3 p16基因缺失組與無缺失組患者DFS比較

2.4 伴CD20 陽性表達的p16 基因缺失與無缺失患者預(yù)后比較 p16基因缺失組CD20陽性、CD20陰性以及無缺失組CD20陽性、CD20陰性患者的中位OS分別為 19 個月、29 個月、35 個月及 48 個月，中位DFS 分別為 11 個月、21 個月、32 個月及 38 個月。p16 基因缺失組 CD20 陽性患者 OS 和 DFS 均明顯低于缺失組CD20陰性者（OS：Log-rankχ2=7.782；DFS：Log-rankχ2=5.733；均P＜0.05）、無缺失組 CD20 陽性者（OS：Log-rankχ2=13.731；DFS：Log-rankχ2=17.450；均P＜0.05）及無缺失組CD20 陰性者（OS：Log-rankχ2=32.163；DFS：Log-rankχ2=34.372；均P＜0.05），無缺失組中CD20陽性者與陰性者間差異無統(tǒng)計學意義（OS：Log-rankχ2=0.289 6；DFS：Logrankχ2=0.074 2；均P＞0.05），見圖6、7。

Fig.4 Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients received Allo-HSCT treatment and chemotherapy treatment圖4 p16基因缺失移植組與化療組患者OS比較

Fig.5 Kaplan-Meier survival curves for disease free survival in patients received Allo-HSCT treatment and chemotherapy treatment圖5 p16基因缺失移植組與化療組患者DFS比較

Fig.6 Kaplan-Meier survival curves for overall survival in patients with different status of p16 gene and CD20圖6 p16基因缺失組CD20陽性、CD20陰性以及無缺失組CD20陽性、CD20陰性患者OS比較

2.5 伴p16 基因缺失的MLL 重排B-ALL 患者預(yù)后分析 5 例伴p16 基因缺失的MLL 重排患者中有3例復(fù)發(fā)；4 例患者在2年之內(nèi)死亡，僅1 例接受造血干細胞移植患者截至隨訪日止仍存活，其發(fā)病后生存時間為28個月。

Fig.7 Kaplan-Meier survival curves for disease free survival in patients with different status of p16 gene and CD20圖7 p16基因缺失組CD20陽性、CD20陰性以及無缺失組CD20陽性、CD20陰性患者DFS比較

3 討論

p16 基因缺失是成人ALL 最常見的細胞遺傳學改變之一，目前多數(shù)研究認為p16 基因缺失是ALL患者預(yù)后不良的獨立危險因素之一。本研究結(jié)果顯示，與無缺失組比較，p16 基因缺失組患者復(fù)發(fā)率高、2年OS和DFS率較低，與Braun等［8］的報道一致。本研究發(fā)現(xiàn)p16基因缺失率在復(fù)發(fā)患者中高于初發(fā)患者，有4 例患者初發(fā)時p16 基因無缺失，而復(fù)發(fā)時出現(xiàn)p16基因缺失，與Mullighan等［9］的報道一致，其研究發(fā)現(xiàn)部分ALL 復(fù)發(fā)患者出現(xiàn)基因拷貝缺失，其中56%為p16 基因缺失。對p16 基因缺失患者治療效果進行分析發(fā)現(xiàn)，造血干細胞移植能明顯改善預(yù)后，與以往研究結(jié)果一致［3］。根據(jù)以上結(jié)果推測p16基因缺失與成人Ph 陰性B-ALL 患者的復(fù)發(fā)及進展有關(guān)，造血干細胞移植能改善患者的預(yù)后。

本研究對患者的免疫分型進行分析發(fā)現(xiàn)，p16基因缺失患者CD20 陽性率明顯高于無缺失患者，p16基因缺失伴CD20陽性患者的預(yù)后明顯差于p16基因缺失伴CD20 陰性患者；而在無p16 缺失患者中，CD20陽性與CD20陰性組患者預(yù)后無明顯差異。目前關(guān)于CD20陽性表達對于B-ALL預(yù)后的影響仍具有爭議，有研究認為CD20 表達陽性對成人BALL預(yù)后無影響［10］，而多數(shù)研究認為CD20是ALL患者預(yù)后不良的獨立危險因素之一，CD20陽性ALL患者的3年持續(xù)緩解率及3年OS 率均明顯低于CD20陰性者［11］，CD20陽性Ph陰性ALL患者3年累積復(fù)發(fā)率較CD20陰性者明顯升高［12］。有研究表明，利妥昔單抗聯(lián)合標準化療較單純化療能明顯提高CD20 陽性ALL患者的預(yù)后［13-14］。

MLL重排是ALL患者預(yù)后不良的重要的遺傳學異常之一。目前關(guān)于p16基因缺失對MLL重排ALL患者預(yù)后影響的研究尚少見。Ohnishi 等［15］研究表明，示MLL 重排患者中p16 基因缺失率為19%，且p16基因缺失提示MLL重排患者預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示，18 例 MLL 重排 ph 陰性 B-ALL 患者中，5例伴p16 基因缺失（27.7%），且其中4 例均于發(fā)病2年內(nèi)死亡，與Ohnishi等［15］的研究一致。有研究表明p16基因在MLL重排白血病細胞增殖及凋亡中起關(guān)鍵性作用，不同的上游基因，均通過抑制p16基因的表達，從而促進MLL重排白血病細胞的增殖和抑制其凋亡［16-17］。

綜上所述，p16 基因缺失是成人Ph 陰性ALL 患者預(yù)后不良的危險因素，其在白血病的復(fù)發(fā)及進展中起重要作用，造血干細胞移植能明顯改善該部分患者的預(yù)后。伴p16基因缺失患者CD20陽性率高，這部分患者預(yù)后較差。在診斷時明確p16基因缺失狀態(tài)對于指導(dǎo)疾病危險分層及選擇合適的治療方案具有重要意義。