晉春霞，肖亞朋，習(xí)向鋒，楊沛沛，孫哲，王杰，王迎迎，趙坤坤，劉守川

（洛陽(yáng)中科基因檢測(cè)診斷中心有限公司，河南洛陽(yáng) 471003）

雞傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease，IBD）又稱甘布羅病，是由雞傳染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高度接觸傳染性疾病[1]。鄺榮祿于1979 年在廣州首先發(fā)現(xiàn)我國(guó)存在該病，此后北京、上海、廣東等地也發(fā)現(xiàn)了該病[2，3]。由于該病發(fā)病突然、病程短、死亡率高，且可引起雞體免疫抑制，目前仍然是養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病之一。1987 年比利時(shí)北部和荷蘭南部均發(fā)現(xiàn)IBDV 超強(qiáng)毒株，我國(guó)于1990年后也有報(bào)道分離到超強(qiáng)毒株與變異株，給養(yǎng)禽業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失[4]，同時(shí)給本病的防控也帶來(lái)了難度。

疫苗免疫仍是目前最常用且最有效的手段之一，國(guó)內(nèi)本病的商業(yè)化疫苗眾多。常用的有活苗和滅活苗兩大類，活苗有全病毒弱毒疫苗（包括抗原抗體復(fù)合物疫苗）和基因工程亞單位活載體疫苗；滅活苗有全病毒滅活疫苗和基因工程亞單位疫苗。滅活苗包括單苗和聯(lián)苗，主要以聯(lián)苗使用為主。市場(chǎng)上有多家商品化死苗，但質(zhì)量孰優(yōu)孰劣難以主觀評(píng)判。本試驗(yàn)選用四種商品化IBD 死苗進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)，現(xiàn)將研究報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 疫苗

4 種商品化疫苗，分別標(biāo)記為A～D，其中A 為IBD 亞單位滅活聯(lián)苗，B～D 為全病毒滅活聯(lián)苗，均購(gòu)自市場(chǎng)。

1.2 攻毒毒株

IBDV BC6/85 株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1 日齡SPF 雞，由購(gòu)自山東斯帕法斯公司的SPF 種蛋自行孵化而來(lái)。

1.4 檢測(cè)試劑

IBD 標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，批號(hào)201603，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，批號(hào)201701，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；IBD ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒，批號(hào)LN448，購(gòu)自IDEXX 公司。

1.5 方法

1.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用54 只1 日齡SPF 雞，分6 組，A-E 組每組10只，F(xiàn) 組4 只（見(jiàn)表1）。A～D 組分別頸部皮下接種疫苗，0.2mL/只，E 組、F 組不免疫。免疫后14、21、28 日，分別翅下靜脈采血，分離血清，測(cè)定IBD 的瓊擴(kuò)抗體、ELISA 抗體。免疫后30 日，除F 組外，各組試驗(yàn)雞用IBDV 標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒BC6/85 株點(diǎn)眼攻毒0.1mL（含100BID），各組隔離飼養(yǎng)。每日觀察并記錄各組試驗(yàn)雞發(fā)病和死亡情況，至攻毒后96 小時(shí)剖殺所有試驗(yàn)雞，觀察法氏囊病變。法氏囊病變的判定標(biāo)準(zhǔn)：法氏囊出現(xiàn)腫大、萎縮、出血、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等一種以上病變。

表1：試驗(yàn)分組情況

1.5.2 IBD 瓊擴(kuò)抗體測(cè)定方法

稱取瓊脂糖1g，氯化鈉8g，倒入100mL 蒸餾水中混勻加熱溶解后，將其倒入90mm 潔凈玻璃平皿中，每個(gè)平皿20mL，靜置冷卻凝固后即為瓊脂平板；用梅花打孔器在所制備的瓊脂平板上打孔，中心與外周孔徑均為3mm，中心孔與外周孔間距也為3mm，封底后進(jìn)行加樣；中間空加入 IBD 標(biāo)準(zhǔn)瓊擴(kuò)抗原，外周孔分別加入陰性對(duì)照、不同倍數(shù)稀釋的陽(yáng)性血清、不同倍數(shù)稀釋的被檢血清；標(biāo)記清楚倒置于濕盒中37℃孵育72h 判定結(jié)果。陰陽(yáng)性對(duì)照成立的條件下，被檢血清與抗原產(chǎn)生沉淀線的最高稀釋度即為該血清的AGP 效價(jià)。

1.5.3 IBD ELISA 抗體測(cè)定方法

按廠家說(shuō)明書進(jìn)行。簡(jiǎn)要步驟如下：試劑回溫后進(jìn)行稀釋樣品、加樣，加樣布局標(biāo)記清楚，加好樣品的反應(yīng)板放18～26℃孵育30min，洗板后加入酶標(biāo)抗體，18～26℃孵育30min，再次進(jìn)行洗板后加入底物，18～26℃避光靜置15min 孵育顯色，加入終止液在酶標(biāo)儀讀數(shù)后進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測(cè)結(jié)果

免后14 日僅D 組可檢測(cè)到IBDV ELISA 抗體，抗體陽(yáng)性率為80%，其余組抗體均為陰性；免后21 日A-D組均檢測(cè)到抗體，但僅C 組和D 組抗體陽(yáng)性率在80%以上；免后28 日抗體陽(yáng)性率與21 日情況相同（見(jiàn)圖1）。從ELISA 抗體平均效價(jià)（GMT）可看到，無(wú)論是免后21日還是28 日，D 組最高，C 組次之（見(jiàn)圖2）。

AGP 抗體與ELISA 抗體產(chǎn)生情況基本一致。免后14 日A～D 組均可檢測(cè)到IBDV AGP 抗體，但陽(yáng)性率均在30%以下；至免疫后21、28 日，僅C 組和D 組抗體陽(yáng)性率在80%以上（見(jiàn)圖3）。從AGP 抗體平均效價(jià)（GMT）看，免后14～28 日，各組抗體呈逐步上升趨勢(shì)，但以D 組抗體水平最高，其次是C 組（見(jiàn)圖4）。

2.2 攻毒保護(hù)結(jié)果

免后30 日攻毒，攻毒后96h 剖殺，觀察法氏囊病變。結(jié)果空白對(duì)照組試驗(yàn)雞均未見(jiàn)任何臨床表現(xiàn)，法氏囊正常（見(jiàn)圖5A）；攻毒對(duì)照組試驗(yàn)雞100%發(fā)病，出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬松等臨床表現(xiàn)，剖檢后法氏囊均有明顯病理變化（見(jiàn)圖5B），取法氏囊用固定液固定后進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)均為法氏囊抗原陽(yáng)性（見(jiàn)圖6A、圖6B）；免疫組呈現(xiàn)不同程度的保護(hù)率，其中C、D 組100%保護(hù)，A、B 組分別60%、80%保護(hù)（見(jiàn)圖7）。

圖1：免后不同時(shí)間各組ELISA 抗體陽(yáng)性率

圖2：免后不同時(shí)間各組ELISA 抗體平均水平（GMT）

圖3：免后不同時(shí)間各組AGP 抗體陽(yáng)性率

圖4：免后不同時(shí)間各組AGP 抗體平均水平（GMT）

圖5：試驗(yàn)雞法氏囊病理變化

圖6：試驗(yàn)雞法氏囊免疫組化檢測(cè)

圖7：不同IBD 疫苗免疫組攻毒保護(hù)率

3 討論

3.1 四種IBD 滅活苗免疫1 日齡SPF 雞，無(wú)論是ELISA 抗體、AGP 抗體還是攻毒保護(hù)，都呈現(xiàn)出一致的差異：D 苗最好，C 苗次之，A 苗、B 苗較差。這為選擇疫苗提供了一定的參考依據(jù)。各疫苗存在的這種差異，可能與疫苗中IBDV 抗原的含量不同相關(guān)，也可能與疫苗保存運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程相關(guān)。

3.2 IBD 疫苗所產(chǎn)生的ELISA 抗體水平還是AGP 抗體水平，都與IBDV 攻毒保護(hù)呈現(xiàn)正相關(guān)，這與文獻(xiàn)所報(bào)道的IBD 疫苗所產(chǎn)生的AGP 效價(jià)與攻毒保護(hù)呈正相關(guān)的結(jié)論是一致的[5]。因此，采用ELISA 和AGP 方法都可以很好的評(píng)價(jià)IBD 滅活疫苗的免疫效果。