田龍夫 張琦 崔立華 楊磊 周易 田余 馬波

1黃岡市中心醫(yī)院腫瘤科，黃岡 438000；2天津市中西結(jié)合醫(yī)院南開醫(yī)院天津市急腹癥器官損傷中西醫(yī)結(jié)合修復(fù)重點實驗室，天津 300100；3天津市南開醫(yī)院腫瘤外Ⅱ科，天津 300100

馬錢子堿是來源于傳統(tǒng)中草藥馬錢子中的一種弱堿性吲哚型生物堿，又叫番木鱉堿，分子式C23H26N2O4，相對分子質(zhì)量394 000，主要存在于馬前科植物馬錢子干燥的成熟種子，在《本草綱目》中記載“狀似馬之連錢，故名馬錢”。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫等功效[1]，對結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等均具有抗腫瘤作用[2-7]，但其在治療胰腺癌方面的相關(guān)研究國內(nèi)外均未見報道。本研究觀察馬錢子堿對人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞系由天津市南開醫(yī)院天津市急腹癥器官損傷中西醫(yī)結(jié)合修復(fù)重點實驗室張琦博士惠贈。馬錢子堿(Brucine)購于中國成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司(批號：357573)。DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclonge公司，二甲基亞砜購自Solarbio公司，MTT粉購自Amresco公司；細(xì)胞裂解液(RIPA)和BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司，磷脂結(jié)合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Wanleibio公司，花青染料(JC-1)試劑盒購自YEASEN公司，Immobilon-P轉(zhuǎn)印膜購自Millipore公司；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、GAPDH一抗及抗兔IgG均購自Cell Signaling Technology公司。

二、細(xì)胞增殖抑制率檢測

采用MTT比色法檢測CFPAC-1細(xì)胞的增殖抑制率。CFPAC-1細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期CFPAC-1細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后制成單細(xì)胞懸液，按5×103個細(xì)胞/200 μl接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)到細(xì)胞完全貼壁后清洗2次，加入含有馬錢子堿終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L的DMEM培養(yǎng)液分別孵育24、48、72 h，以不加馬錢子堿干預(yù)作為對照組。每個濃度、每個培養(yǎng)時間均設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)到時間點時每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸掉上清液，每孔加入DMSO 150 μl，常溫下低速振蕩15 min，置全自動酶標(biāo)儀以570 nm波長測每孔A570值，根據(jù)(1-加藥組平均A570值/對照組平均A570值)×100%公式計算增殖抑制率。

三、細(xì)胞凋亡率檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。取對數(shù)生長期CFPAC-1細(xì)胞，以3×105個細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后應(yīng)用0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)48 h，以不加馬錢子堿干預(yù)作為對照組。消化并收集細(xì)胞后，取1 ml細(xì)胞懸液分別加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混勻后室溫避光10 min，再加10 μl的PI染色液，混勻后避光反應(yīng)5 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

四、線粒體膜電位檢測

采用JC-1染色法檢測細(xì)胞線粒體膜電位。取對數(shù)生長期CFPAC-1細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞完全貼壁后應(yīng)用0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)48 h，以不加馬錢子堿干預(yù)作為對照組，按照J(rèn)C-1試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，置于倒置熒光顯微鏡下觀察紅、綠色熒光強(qiáng)度的變化并攝片。

五、細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測

取對數(shù)生長期CFPAC-1細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后采用0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)48 h，以不加馬錢子堿干預(yù)作為對照組，置冰上用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法定量蛋白，取40 μg樣本行蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。抗Bcl-2、Bax一抗1∶1 000稀釋，二抗1∶1 000稀釋，最后使用ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。用Quantity One軟件分析獲取條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比為蛋白相對表達(dá)量。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、馬錢子堿對CFPAC-1細(xì)胞的增殖抑制率

馬錢子堿干預(yù)呈濃度及時間依賴性地抑制CFPAC-1細(xì)胞的增殖，其中，同一時間0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)對CFPAC-1細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對照組，且不同時間兩兩組間比較的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

組別增殖抑制率24 h48 h72 h對照組0000.05 mmol/L9.43±0.4913.53±1.0317.32±0.960.1 mmol/L14.72±1.3917.43±0.5521.38±0.760.2 mmol/L18.06±0.4021.83±0.9126.41±0.850.4 mmol/L30.23±0.55a40.61±0.15a46.98±1.27a0.8 mmol/L50.17±0.75ab61.23±0.91ab70.32±0.40ab

注：同一時間不同濃度組與對照組比較，aP<0.05；同一濃度不同時間兩兩組間比較，bP<0.05

二、馬錢子堿對CFPAC-1細(xì)胞凋亡率的影響

對照組及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)組CFPAC-1的細(xì)胞凋亡率分別為(2.92±0.46)%、(4.64±1.31)%、(13.09±0.65)%，隨藥物濃度增加而逐漸升高，其中0.8 mmol/L干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 對照組(1A)及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)組(1B、1C)CFPAC-1細(xì)胞凋亡率比較

三、CFPAC-1細(xì)胞線粒體膜電位的變化

JC-1聚集物提示未凋亡的活細(xì)胞呈紅色熒光形式存在，JC-1熒光單體提示凋亡和壞死細(xì)胞呈綠色熒光形式存在。對照組JC-1以聚合物形式出現(xiàn)紅色熒光。0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)CFPAC-1細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增加紅色熒光逐漸減少，而綠色熒光逐漸增多，提示線粒體膜電位受到重度破壞而降低(圖2)。

四、馬錢子堿對CFPAC-1細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

對照組及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)組CFPAC-1細(xì)胞的Bcl蛋白表達(dá)量分別為(0.92±0.12)、(0.67±0.14)、(0.35±0.14)mmol/L；Bax蛋白表達(dá)量分別為(0.56±0.12)、(0.85±0.10)、(1.15±0.12)mmol/L。隨馬錢子堿濃度增加，Bcl-2表達(dá)量顯著下調(diào)，而Bax表達(dá)量顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，圖3)。

圖2 對照組(2A)及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)組(2B、2C)48 h后CFPAC-1細(xì)胞線粒體膜電位變化(熒光顯微鏡 ×200倍；上圖為JC-1紅色熒光聚合物，下圖為JC-1綠色熒光單體)

圖3 對照組(1)及0.4、0.8 mmol/L馬錢子堿干預(yù)組(2、3)CFPAC-1細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

討 論

胰腺癌是一種被稱為“癌中之王”的消化道惡性腫瘤，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，細(xì)胞凋亡在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中占有十分重要的地位[8]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡，線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑均參與細(xì)胞凋亡，以線粒體凋亡途徑最為經(jīng)典。該途徑具有3個明顯特點：磷脂酰絲氨酸膜外翻提示早期凋亡發(fā)生，線粒體損傷體現(xiàn)在線粒體膜電位降低提示中期凋亡，DNA鏈斷裂提示晚期凋亡。在內(nèi)源性線粒體途徑中Bcl-2家族蛋白調(diào)控線粒體完整性，包括蛋白Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax、Bid、Bak)等[9]，Bcl-2是抑制凋亡蛋白重要基因，Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白關(guān)鍵基因，均為主要影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素[10]。

近年來馬錢子堿已被逐步證實具有抗腫瘤作用，其機(jī)制主要表現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、調(diào)控信號通路及抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等方面[2-7]。李苗等[4]研究證實，馬錢子堿通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白 E的表達(dá)，阻斷G0/G1期細(xì)胞周期，抑制人肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9的增殖。Deng等[11]研究證實，馬錢子堿能誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡，其機(jī)制是損害線粒體膜電位，引起Ca2+升高，且降低Bcl-2蛋白表達(dá)[12]。馮靜和馬艷萍[13]研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿可上調(diào)人骨髓瘤U266細(xì)胞的半胱氨酸蛋白酶-8、Bax蛋白表達(dá)，同時下調(diào)JAK-STAT通路中轉(zhuǎn)錄激活因子-3、轉(zhuǎn)錄激活因子-5的mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時也能阻滯細(xì)胞周期及損傷線粒體膜蛋白，致使細(xì)胞色素C釋放誘導(dǎo)人多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞凋亡[7]。余志艷和李平[14]研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿作用人乳腺癌MDA-MB-231后可下調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因Bax和半胱氨酸蛋白酶-3表達(dá)。馬錢子堿也能明顯抑制人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，馬錢子堿呈藥物劑量及時間依賴性抑制CFPAC-1細(xì)胞增殖，增加CFPAC-1的細(xì)胞凋亡率，降低線粒體膜電位變化，使Bax表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)，提示膜電位可能對線粒體凋亡途徑有一定作用，但馬錢子堿治療胰腺癌其他相關(guān)作用機(jī)制還有待后續(xù)更深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突