梁 媛，高靜靜，劉玥蕓，岳利峰，黃曉華，甘大楠，東瀟博，康 慶，康 杰，趙 歆△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700； 4. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

抑郁癥是一種常見的精神失調(diào)癥狀，表現(xiàn)為興趣喪失、焦慮不安、恐懼、心情壓抑等，隨著現(xiàn)代社會(huì)壓力的增大發(fā)病率逐年升高。目前抑郁癥的發(fā)病機(jī)制未明。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠有食欲下降、體質(zhì)量減輕、糖水消耗減少等快感缺乏和攝食異常表現(xiàn)，疏肝解郁名方逍遙散對(duì)此有明顯的改善作用[1-2]。食欲降低、快感缺乏(興趣喪失)是獎(jiǎng)賞功能受損的重要表現(xiàn)。本研究以慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激塑造抑郁癥大鼠模型，觀察模型大鼠血清多巴胺(DA)、食欲素-A(orexin A)與瘦素(leptin)的變化及逍遙散對(duì)其影響，從食欲與獎(jiǎng)賞角度探討逍遙散干預(yù)應(yīng)激性抑郁的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用健康雄性(sprague-dawley，SD)大鼠60只，體質(zhì)量180～220g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0009)。于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 中藥及制備

實(shí)驗(yàn)所用的中藥復(fù)方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散[3]。方藥組成如下：柴胡15 g，當(dāng)歸15 g，白芍15 g，白術(shù)15 g，茯苓15 g，生姜5 g，薄荷5 g，炙甘草7.5 g。以上中藥分別加10倍、8倍、8 倍水，煎煮3 次，過濾沉渣，濃縮，低溫真空干燥為浸膏，粉碎，低溫干燥備用。

1.3 應(yīng)激易感大鼠篩選與分組

先對(duì)50只大鼠進(jìn)行糖水訓(xùn)練。適應(yīng)飼養(yǎng)第4天開始分籠孤養(yǎng)，每天1 h，連續(xù)9 d，禁食禁水12 h后給予1%蔗糖水和純水各1瓶，記錄糖水基線消耗量。第10天開始施加慢性不可預(yù)見應(yīng)激因素，應(yīng)激14 d后進(jìn)行糖水測試。按測試結(jié)果將應(yīng)激大鼠分為應(yīng)激易感大鼠(糖水消耗下降40%以上)與應(yīng)激恢復(fù)大鼠(糖水消耗未減少)。應(yīng)激易感大鼠共篩選出30只納入下一步實(shí)驗(yàn)，按隨機(jī)區(qū)組方法隨機(jī)分為慢性不可預(yù)見應(yīng)激模型組和逍遙散組各15只。另外10只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，5只一籠群養(yǎng)。模型組與逍遙散組繼續(xù)施加4周的應(yīng)激因素。逍遙散組從第3周開始進(jìn)行逍遙散藥物干預(yù)。

1.4 造模方法

每周禁食禁水12 h，強(qiáng)迫冰水游泳10 min，夾尾3 min，束縛3 h(采用自制木質(zhì)束縛架，底座長20 cm，寬9.5 cm。束縛臺(tái)長18 cm，寬6.5 cm，高10 cm，兩側(cè)分別有適合四肢放置的凹槽及兩條可調(diào)節(jié)的黏貼軟帶，用來固定大鼠的胸部和腹部。托板面釘有3條束縛帶以固定大鼠)，潮濕墊料(300 mL 水潑入墊料中)24 h，熱刺激10 min(Homecare電磁波治療儀，40°)，白噪聲刺激(90 db)6 h，7種應(yīng)激因素中隨機(jī)選擇1種。模型組與逍遙散組連續(xù)造模共6周。

1.5 給藥方法

逍遙散組從第3周開始進(jìn)行逍遙散藥物干預(yù)，灌胃時(shí)間4周。每天開始應(yīng)激前30 min給藥。逍遙散組灌胃逍遙散懸液(按人體用藥量換算成大鼠5倍劑量，給藥量為4.6125 g/(kg·d)，灌胃容積為1 mL/100 g體質(zhì)量。模型組和正常組灌胃相同體積純水。

1.6 行為學(xué)檢測

1.6.1 一般狀態(tài)觀察 每日給藥前，仔細(xì)觀察大鼠的精神狀態(tài)、姿勢、皮毛色澤、活動(dòng)度、對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)性以及糞便等全身情況，每周測量各組大鼠體質(zhì)量。

1.6.2 新環(huán)境進(jìn)食壓抑實(shí)驗(yàn) 造模結(jié)束第2天，大鼠禁食禁水12 h后，將大鼠放在等待室準(zhǔn)備進(jìn)行新環(huán)境進(jìn)食壓抑實(shí)驗(yàn)。使用規(guī)格為350×470×200 cm的全新透明鼠籠，籠蓋投食處放置事先稱量好的粉紅色高脂飼料30 g。仔細(xì)觀察15 min，記錄由放入大鼠到大鼠前肢抱住食物開始的進(jìn)食時(shí)間(進(jìn)食潛伏期)和15 min內(nèi)的進(jìn)食時(shí)間。15 min結(jié)束后將大鼠取出，稱出剩余飼料的重量并計(jì)算每只大鼠的進(jìn)食量。潛伏期、進(jìn)食時(shí)間和進(jìn)食量均反映了大鼠的抑郁程度。

1.7 取材與指標(biāo)檢測方法

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，第2天早上8∶00,將各組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(40 mg/kg)后，仰臥固定于鼠板，剪開腹腔暴露腹主動(dòng)脈，將無菌采血針一端刺入腹主動(dòng)脈，另一端連接無菌3 mL真空采血管，待采血管滿后拔出采血針。將采血管室溫靜置2 h后，離心10 min(4℃，12 000 g)，吸取上清液分裝至凍存管內(nèi)，編號(hào)標(biāo)記后-80 ℃保存。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組大鼠血清DA、orexin A、leptin含量，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。Rat DA ELISA Kit(武漢六合)，orexin A ELISA Kit(Phoenix)，Rat leptin ELISA Kit(Raybio)試劑盒均由北京百諾威生物技術(shù)有限公司提供。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察結(jié)果

造模6周結(jié)束時(shí)，正常組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，體質(zhì)量增長較快，皮毛潔白光澤，皮膚黏膜紅潤，球形糞便且干稀適中。模型組大鼠在造模過程中死亡1只，剩余14只大鼠神態(tài)倦怠，體質(zhì)量減輕，毛發(fā)較少光澤，胡須下垂，耳廓色淡，活動(dòng)減少或蟄伏在角落，大便多稀溏。逍遙散組大鼠因造模與灌胃等原因死亡5只，剩余10只大鼠，一般狀態(tài)處于正常組與模型組之間。

2.2 各組大鼠新環(huán)境進(jìn)食壓抑實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、進(jìn)食時(shí)間與進(jìn)食量比較均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，進(jìn)食潛伏期明顯延長(P<0.05)。表現(xiàn)出長期接受慢性不可預(yù)見應(yīng)激，使模型大鼠對(duì)食物的興趣下降，食物攝入減少是導(dǎo)致其體質(zhì)量下降的重要原因之一。與模型組比較，逍遙散組大鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.05)，進(jìn)食量有增長趨勢但未見差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明逍遙散具有一定的治療作用。

2.3 各組大鼠血清ELISA檢測結(jié)果

表2顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清DA 水平明顯降低(P<0.05)，逍遙散上調(diào)作用極其顯著(P<0.01)。血清leptin和orexin A含量方面，模型組均較正常組明顯降低(P<0.05，P<0.01)，逍遙散組大鼠血清orexin A含量較模型組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，逍遙散對(duì)模型大鼠血清leptin含量也有上調(diào)作用，但未見明顯差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠新環(huán)境進(jìn)食壓抑實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05

表3 各組大鼠血清DA、orexin A、leptin含量結(jié)果比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

抑郁癥的核心癥狀包括快感缺乏、興趣下降，是獎(jiǎng)賞功能失調(diào)的具體表現(xiàn)，在大鼠可表現(xiàn)為進(jìn)食、性行為和糖水消耗減少。正常的獎(jiǎng)賞效應(yīng)有利于個(gè)體適應(yīng)外部環(huán)境，維持?jǐn)z食、性等基本的本能行為。但獎(jiǎng)賞功能一旦被異常激活，就會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)的慢性適應(yīng)性改變，反而會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害[4]。相對(duì)于藥物獎(jiǎng)賞，食物、水、金錢、音樂等被稱為天然獎(jiǎng)賞(natural reward)。天然獎(jiǎng)賞的種類很多。 本研究選擇從攝食方面進(jìn)行觀察，評(píng)價(jià)慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激對(duì)大鼠在陌生環(huán)境下進(jìn)食行為的影響。

有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，慢性應(yīng)激大鼠糖水實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不穩(wěn)定，考慮到可能與單只大鼠本身對(duì)慢性應(yīng)激的易感性并不相同有關(guān)。故在本研究中，先對(duì)大鼠施加2周的慢性不可預(yù)見應(yīng)激，通過糖水測試篩選出糖水?dāng)z入減少的“應(yīng)激敏感型”大鼠，再進(jìn)行造模，以期進(jìn)一步提高抑郁大鼠模型的成功率。模型大鼠糖水?dāng)z入量減少，說明慢性應(yīng)激造成實(shí)驗(yàn)大鼠對(duì)獎(jiǎng)勵(lì)反應(yīng)有所下降，在此基礎(chǔ)上通過新環(huán)境進(jìn)食壓抑實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察其對(duì)食物的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠進(jìn)食潛伏期明顯延長，說明施加慢性不可預(yù)見應(yīng)激因素對(duì)大鼠造成了負(fù)面影響，說明其對(duì)獎(jiǎng)賞的反應(yīng)性下降、興趣降低，對(duì)周圍環(huán)境的判斷能力下降。進(jìn)食時(shí)間與進(jìn)食量均明顯降低，表現(xiàn)出模型大鼠對(duì)食物的敏感性降低，食物攝入減少也是導(dǎo)致其體質(zhì)量下降的重要原因之一。與模型組比較，逍遙散組大鼠體質(zhì)量增加，進(jìn)食量有所增長，說明逍遙散具有一定的治療作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，逍遙散對(duì)慢性應(yīng)激造成的大鼠攝食量減少有明顯的上調(diào)作用，提示逍遙散的疏肝健脾功效對(duì)抑郁大鼠的情緒與食欲均有較好的調(diào)節(jié)作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，大腦神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、DA 等在神經(jīng)突觸間的濃度相對(duì)或絕對(duì)不足，是抑郁癥發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)[4]。DA是大腦調(diào)節(jié)獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，一系列的實(shí)驗(yàn)證明，幾乎所有的長期抗抑郁治療的患者都會(huì)增加DA誘導(dǎo)的獎(jiǎng)賞反應(yīng)[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激模型大鼠血清DA水平明顯降低，結(jié)合行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫笫秤档偷陌Y狀表現(xiàn)，可以認(rèn)為通過施加慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激因素造成的抑郁癥大鼠模型，已經(jīng)出現(xiàn)快樂體驗(yàn)?zāi)芰档偷暮诵陌Y狀，提示造模成功。

食欲素(orexins)和瘦素(leptin)都是參與調(diào)節(jié)食欲和機(jī)體能量代謝的肽類物質(zhì)[6]。leptin由成熟的脂肪細(xì)胞分泌, 經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),行為學(xué)、電生理學(xué)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，leptin缺乏將導(dǎo)致機(jī)體因攝食過量而肥胖，證明leptin是攝食調(diào)節(jié)和維持機(jī)體能量及代謝平衡的極其重要的影響因子[7]。orexins有刺激動(dòng)物攝食作用，參與食物、性等自然獎(jiǎng)賞過程，一種可能的解釋是orexins調(diào)節(jié)獎(jiǎng)賞與應(yīng)激過程中的喚醒狀態(tài)[8]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，orexins與下丘腦 leptin 存在相互作用,下丘腦外側(cè)區(qū) (LHA)的leptin通過作用于其受體調(diào)控orexins神經(jīng)元的活性[9]。

食欲素可分泌orexin A 和orexin B 兩種小分子多肽，目前研究較多的是orexin A, 其與攝食行為調(diào)控和肥胖發(fā)生密切相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，長期接受輕度不可預(yù)見應(yīng)激的大鼠血清orexin A水平較正常大鼠明顯下降，作為一種劑量性依賴增加攝食的食欲調(diào)節(jié)因子，Orexin A 減少會(huì)導(dǎo)致模型大鼠對(duì)食物的渴求下降和進(jìn)食減少，這可能是抑郁大鼠食欲下降與體質(zhì)量降低的原因之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，長期接受輕度應(yīng)激后大鼠血清中的leptin水平也出現(xiàn)明顯降低。

leptin和orexin是兩種相反作用的多肽，均作用于下丘腦，前者可使食欲下降、活動(dòng)增加而減肥；后者則促進(jìn)食欲，可能造成肥胖。有研究人員給予大鼠皮下注射orexin A后，其體內(nèi)的leptin水平明顯升高；注射leptin后，其體內(nèi)的orexin A水平顯著降低，說明leptin和orexin之間是相互影響的關(guān)系[11]。這兩種中樞作用截然相反的因子在外周血中的含量均明顯下降，可能說明慢性輕度不可預(yù)見應(yīng)激模型中orexin與leptin間原有的平衡狀態(tài)受到嚴(yán)重破壞，進(jìn)而引起一系列本能需求減弱的抑郁樣表現(xiàn)。

逍遙散始載于宋代《太平惠民和劑局方》，方由柴胡、當(dāng)歸、芍藥、薄荷、茯苓、白術(shù)、生姜、甘草組成，功效疏肝解郁、健脾養(yǎng)血。本研究用疏肝解郁的名方逍遙散對(duì)慢性不可預(yù)見應(yīng)激大鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)血清DA、orexin A和leptin水平均有積極的上調(diào)作用，且能提高大鼠的進(jìn)食量與體質(zhì)量，進(jìn)一步提示逍遙散具有確切的抗抑郁作用。

國外的研究表明，leptin缺乏的小鼠下丘腦弓狀核DA水平下降。還有研究發(fā)現(xiàn)，leptin能抑制DA神經(jīng)元的活動(dòng)，DA在伏核水平下降，從而食物攝入減少[9]，這也與本研究結(jié)果一致。orexin是食欲促進(jìn)因子，leptin是食欲抑制因子，二者均與抑郁導(dǎo)致的攝食異常、興趣缺失有關(guān)，而這些行為的改變又與獎(jiǎng)賞系統(tǒng)有著密切聯(lián)系。當(dāng)leptin-orexin在獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的調(diào)制失衡，則可能會(huì)引起DA釋放減少，導(dǎo)致快樂體驗(yàn)?zāi)芰θ狈Αｅ羞b散可能通過調(diào)節(jié)orexin-leptin的平衡協(xié)調(diào)調(diào)整動(dòng)機(jī)、情緒、認(rèn)知等內(nèi)環(huán)境的自穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而激活DA的分泌，發(fā)揮其在獎(jiǎng)賞過程中的保護(hù)作用。這可能是逍遙散抗抑郁的作用通路之一。至于orexin、leptin和DA三者之間的相互作用機(jī)制，尚待下一步研究發(fā)現(xiàn)。