錢旭東 王東 徐倩倩 李國(guó)蕓 王紅梅 張曉璇 馬征

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000；2呼吸內(nèi)科)

血管性癡呆(VD)發(fā)生的原因主要與腦血管因素有關(guān)，其發(fā)生基礎(chǔ)為腦組織受損而引發(fā)神經(jīng)功能異?！?，2〕。艾地苯醌對(duì)改善多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病造成的認(rèn)知功能下降、VD治療方面有重要的臨床作用〔3～5〕。本實(shí)驗(yàn)擬分析艾地苯醌對(duì)VD大鼠海馬腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)mRNA及高親和力受體酪氨酸激酶(Trk)B mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 選取100只雄性7周齡健康清潔級(jí)SD大鼠〔許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003，合格證號(hào)：1404010，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〕，體重250～300 g。每5只放到1個(gè)籠子中飼養(yǎng)，維持濕度50%～70%，維持室溫為20～25℃，給予顆粒型普通大鼠飼料，造模前予以適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2主要試劑和儀器 TaqMan?RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ABI公司，Lot：20170634)，總RNA抽提試劑盒(No：K0731，美國(guó)賽默飛生物公司)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(Biosens SC710，美國(guó)BIOTOP公司)，熒光定量PCR儀(LightCycler480，美國(guó)羅氏生物)，低速離心機(jī)(TDL5，上海安亭科學(xué)儀器廠)，miScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海凱杰生物公司)，山羊抗小鼠〔辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，上海Abcam公司，貨號(hào)ab6789〕，Western印跡電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad公司，貨號(hào)170-5060)，ZS-001 Moriss 水迷宮(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)，BDNF抗體、TrkB抗體(武漢博士德公司生產(chǎn))；PCR擴(kuò)增引物(上海生工公司生產(chǎn))。

1.3建立模型及分組 模型建立方法：兩血管阻斷法(2-VO)。術(shù)前大鼠禁食12 h，禁水4 h，后腹腔注射10% 水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，選取頸部正中為切口，將雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行分離后用4 號(hào)絲線結(jié)扎，最后將皮膚縫合并在傷口處注射慶大霉素(0.2萬(wàn)U)，以便減小感染發(fā)生率，分離假手術(shù)組雙側(cè)頸動(dòng)脈。艾地苯醌高劑量組、艾地苯醌低劑量組、對(duì)照組在建立模型后第3天進(jìn)行藥物干預(yù)，艾地苯醌高劑量組灌服10 mg/kg艾地苯醌，艾地苯醌低劑量組灌服3 mg/kg艾地苯醌，對(duì)照組灌服11.06 mg/kg尼莫地平。模型組、假手術(shù)組灌服生理鹽水，保持灌服10 ml/kg，1次/d，連續(xù)灌服1個(gè)月。藥物干預(yù)、建立模型完成后剔除死亡大鼠，最終假手術(shù)組、艾地苯醌高劑量組、艾地苯醌低劑量組、對(duì)照組各20只。

1.4檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力情況 藥物干預(yù)1個(gè)月后，Morris 水迷宮測(cè)試所有大鼠，共測(cè)試6 d，在前5 d只需測(cè)試定位航行，第6天測(cè)試空間探索。保持水深35 cm，水溫22℃，追蹤大鼠應(yīng)用攝像頭。對(duì)采集的所有圖像、視頻等及時(shí)導(dǎo)入電腦并對(duì)分析數(shù)據(jù)。定位航行水點(diǎn)標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)：將每一象限的中點(diǎn)作為水點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，在大鼠找平臺(tái)位置的前2 min進(jìn)行記錄，將平臺(tái)上停留時(shí)間>2 s作為逃避潛伏期。1 d記錄4次，最后計(jì)算出平均值?？臻g探索:將平臺(tái)拿走后選擇任何一個(gè)水點(diǎn)將大鼠放入，記錄2 min內(nèi)大鼠跨越平臺(tái)的總次數(shù)，同時(shí)記錄停留時(shí)間。

1.5Western印跡測(cè)定BDNF、TrkB蛋白水平 選取腦組織：將所有大鼠處死后取出腦組織，應(yīng)用刀片切開(kāi)，將完整的左右雙側(cè)海馬進(jìn)行鈍性分離，后將左側(cè)海馬組織及時(shí)放入液氮中冷凍1 h，后將其放入-80℃超低溫冰箱中。取約100 mg 組織后加入1 ml 10×蛋白變性緩沖液，100℃變性5 min，后將變性溶液加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)內(nèi)，將溶液置入90 V恒壓中進(jìn)行100 min電泳，當(dāng)溴酚蘭跑出變性膠后停止電泳，后進(jìn)行轉(zhuǎn)模。恒流轉(zhuǎn)移：在酸纖維素膜上放上SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜成功進(jìn)行封閉(3%BSA)，封閉后將其放在4℃環(huán)境下一夜，第2天磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗硝酸纖維素膜，按1∶500的比例將BDNF單克隆抗體加入其中，后在室溫下孵育45 min，孵育完成PBS沖洗硝酸纖維素膜；后對(duì)二抗進(jìn)行孵育，按1∶1 000的比例將HRP標(biāo)記的二抗加入其中，后室溫下孵育30 min，之后應(yīng)用PBS沖洗硝酸纖維素膜，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，后使用Kodak X曝光3 min進(jìn)行成像操作。檢測(cè)各條帶吸光度值，內(nèi)參照為β-actin，BDNF相對(duì)表達(dá)量應(yīng)用灰度值表示，后采用同樣方法檢測(cè)組織中TrkB的表達(dá)。

1.6熒光定量PCR檢測(cè)BDNF、TrkB mRNA的表達(dá) 組織RNA提取：-80℃超低溫冰箱中取出海馬組織，研缽中迅速磨成粉末狀；取出100 mg粉末加入含有1 ml Trizol裂解液的EP管中，混合均勻；室溫靜止5 min，加入200 μl氯仿，充分混勻，室溫放置10 min；4℃離心分取上層水相，并放置RNase-free 1.5 ml離心管內(nèi)，后加入等量的異丙醇充分震蕩，然后在冰上放置約30 min；取出離心管，再4℃離心分取得到RNA沉淀；應(yīng)用500 μl 75%酒精洗滌RNA沉淀2次，風(fēng)干；再加入50 μl RNase-free水在室溫下溶解RNA；應(yīng)用NanoDrop檢測(cè)提取的RNA濃度，完成后將其放置-20℃條件下備用。

檢測(cè)定量PCR：對(duì)抽取的RNA進(jìn)行體外反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，最終得到產(chǎn)物cDNA，操作時(shí)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；16℃條件下孵育30 min，42℃條件下孵育30 min，后85℃條件下加熱5 min，后放置4℃條件下保存。將cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為T(mén)aqMan?Universal PCR Master Mix 20 μl，操作儀器為羅氏LightCycler480，內(nèi)參照為β-actin表達(dá)水平,ΔCT為BDNF相對(duì)值，ΔCT=CTβ-actin-CTBDNF，引物信息為BDNF：上游引物：5'-AGGGGCATAGACAATCG-3',下游引物:5'-TTCCCCTTGATAATGGTC-3';TrkB:上游引物:5'-AGTCGTCGAGACATGTC-3',下游引物:5'-CTGAAGACGGACTGTTG-3;β-actin:上游引物:5'-GCTGTCCCTGTATGCCTC-3',下游引物:5'-AGATGTCAGCGCACGAC-3'。采用同樣的方法檢測(cè)TrkB在RNA水平的表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.15組定位航行比較 模型組逃避潛伏期〔(60.24±27.84)s〕顯著長(zhǎng)于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術(shù)組、對(duì)照組〔(42.51±20.12)s、(32.28±17.48)s、(21.37±15.45)s、(33.64±18.32)s，P<0.05〕，假手術(shù)組顯著短于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對(duì)照組(P<0.05)；而相比于假手術(shù)組，艾地苯醌高劑量組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.25組空間探索結(jié)果比較 假手術(shù)組穿越原平臺(tái)次數(shù)、原平臺(tái)停留時(shí)間明顯多于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、模型組、對(duì)照組(P<0.05);模型組均明顯少于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對(duì)照組(P<0.05)。艾地苯醌高劑量組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組模型水迷宮探索結(jié)果比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3各組腦海馬BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)比較 模型組BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)水平顯著低于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術(shù)組、對(duì)照組(P<0.05)。與艾地苯醌高劑量組比較，艾地苯醌低劑量組均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

2.4各組腦海馬BDNF mRNA、TrkB mRNA表達(dá)比較 模型組TrkB mRNA、BDNF mRNA表達(dá)水平顯著低于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術(shù)組、對(duì)照組(P<0.05)。與假手術(shù)組相比，艾地苯醌高劑量組和對(duì)照組均無(wú)顯著變化(P>0.05);而艾地苯醌低劑量組均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

A～E：假手術(shù)組、模型組、艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對(duì)照組圖1 各組腦海馬BDNF 和TrkB 蛋白表達(dá)

表2 各組腦海馬BDNF 和TrkB 蛋白及mRNA表達(dá)比較

與模型組比較：1)P<0.05；與艾地苯醌低劑量組比較：2)P<0.05

3 討 論

VD 的發(fā)生主要與腦部血管發(fā)生病變?nèi)X組織或局部腦組織發(fā)生缺氧缺血，最終對(duì)腦部認(rèn)知記憶、神經(jīng)組織造成損傷顯著相關(guān)〔6〕。小腦、海馬體、大腦皮質(zhì)對(duì)缺氧、缺血的敏感度非常高〔7〕。腦部缺血、缺氧導(dǎo)致?lián)p傷發(fā)生后會(huì)引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞死亡、炎性反應(yīng)、梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性、能量衰竭等，發(fā)生反應(yīng)會(huì)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的突觸傳遞、調(diào)節(jié)功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元造成一定的損傷，且會(huì)對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生很大影響〔8，9〕。有研究表明，艾地苯醌可抑制炎性反應(yīng)，進(jìn)而會(huì)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程產(chǎn)生抑制作用，從而在治療VD過(guò)程中發(fā)揮非常重要作用〔10〕。本實(shí)驗(yàn)表明，腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元損傷是引起癡呆的重要原因，艾地苯醌藥可以有效減輕缺氧、缺血對(duì)神經(jīng)元造成的損傷，可以有效保護(hù)海馬神經(jīng)元。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子由多種細(xì)胞分泌，對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，它們通過(guò)自分泌、旁分泌、靶源分泌等多種形式發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)及代謝能力，該因子在修復(fù)損傷神經(jīng)系統(tǒng)方面起著關(guān)鍵性作用〔11～13〕。BDNF廣泛存在于腦組織中，其在皮質(zhì)、海馬體中的含量最多，作用為維持腦缺血后神經(jīng)元的生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)元軸突、樹(shù)突的生長(zhǎng)繁殖，促使神經(jīng)元突觸間遞質(zhì)的分泌等，同時(shí)可以有效改善學(xué)習(xí)記憶功能，改善VD 認(rèn)知功能〔14，15〕。BDNF通常與受體TrkB發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)而會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶的生物活性，誘導(dǎo)TrkB發(fā)生磷酸化等，最終會(huì)刺激下游信號(hào)通路，對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)〔16〕。當(dāng)腦部組織發(fā)生缺氧、缺血時(shí)，BDNF、受體TrkB 的含量會(huì)明顯升高，當(dāng)BDNF、受體TrkB 含量減少時(shí)，會(huì)使動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶受到嚴(yán)重?fù)p傷〔17〕。本研究結(jié)果表明，艾地苯醌可以提高BDNF、受體TrkB水平，可以有效刺激下游信號(hào)通道，進(jìn)而有利于修復(fù)受損海馬神經(jīng)元，最終提高VD 大鼠的學(xué)習(xí)能力、記憶能力。