韋敬錫，凌永嫦，閆位娟

（1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2.中國疾病預防控制中心 輻射防護與核安全醫(yī)學所，北京 100088）

0 引言

宮頸癌是女性最常見的婦科癌癥，嚴重威脅女性健康，其最主要的病因為高危人乳頭瘤病毒侵襲，大多數(shù)侵襲性宮頸癌發(fā)生前存在宮頸發(fā)育不良或原位癌[1]。作為高發(fā)疾病，2008 年全球發(fā)病率估計為53 萬例，約有85%的病例發(fā)生在發(fā)展國家[2,3]。宮頸癌具有癌癥的普遍特點——腫瘤細胞易轉(zhuǎn)移，這是導致宮頸癌治療失敗和死亡的主要原因，目前隨著基礎醫(yī)學的發(fā)展，出現(xiàn)新的分子生物學治療方法，為臨床研究提供新的思路。最近有研究表明微小RNA(miRNAs)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]，可以通過特異性與靶mRNA 相互作用，調(diào)控細胞功能并在腫瘤及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的病理中異常表達，為腫瘤轉(zhuǎn)移的研究開辟新的途徑[5]。miR-424 作為一種抑癌因子，已被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者中其存在下調(diào)的現(xiàn)象，但其作用及機制仍不清楚[6]。有研究報告認為miRNA 對于細胞的作用，是通過參與Wnt/β-catenin 信號通路作用于靶基因從而影響腫瘤細胞的增殖遷移，但仍需高質(zhì)量數(shù)據(jù)進一步證明[7]。對此我們認為miR-424 可能通過調(diào)控Wnt 蛋白（Wnt8A）的表達負調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路，從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，擬研究miR-424 對宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及其對Wnt/β-catenin 信號通路調(diào)節(jié)的機制，以尋求新的治療方法。

1 材料與方法

圖1 技術(shù)路線流程圖

1.1 miR-424 對宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

1.1.1 主要試劑

人宮頸癌細胞HeLa 購于美國ATCC 細胞庫；miR-424 的高效模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）、陰性對照組（negative control,NC）；高糖型DMEM 培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；Transwell 小室及基質(zhì)膠；PBS 緩沖液；蘇木素染色液；Boyden 小室；趨化劑Fibronectin；Trizol 試劑盒。

1.1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱；熒光顯微鏡。

1.1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將細胞培養(yǎng)在5 % CO2培養(yǎng)箱中，溫度37.5 ℃，百分之百相對飽和濕度，培養(yǎng)基為高糖型DMEM 培養(yǎng)基+PBS 緩沖液，進行常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前取生長狀態(tài)良好的細胞用胰酶消化，細胞計數(shù)后，將細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后細胞接種至6 孔板（5×106/孔）中，第二天細胞融合度達70-80 %時，轉(zhuǎn)染miR-424 mimic/inhibitor/NC，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.1.4 劃痕實驗檢測宮頸癌細胞遷移能力

將細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后細胞接種至6 孔板中，培養(yǎng)48 小時后，使用槍頭在6 孔板內(nèi)進行劃痕操作，再用PBS 緩沖液沖細胞3 次，去除劃下的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。后在顯微鏡下拍照記錄，分別在每孔選擇4-6個視野紀錄距離，并按照0、6、12、24 時間點取樣。

1.1.5 Transwell 小室法檢測細胞轉(zhuǎn)移能力

實驗開始前將Transwell 小室聚碳酸酯微孔膜用PBS 緩沖液浸濕，將基質(zhì)膠鋪于小室微膜上。將培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染的細胞以每孔105 個接種于小室的上室，將FBS 緩沖液加入到下室中作為培養(yǎng)液，后放入培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。顯微鏡下管道細胞轉(zhuǎn)移情況，轉(zhuǎn)移多時，取PBS 緩沖液沖洗3 次，再使用蘇木素染色液染色。取出聚碳酸酯微孔膜后在顯微鏡下觀察隨機的5 個視野穿過細胞數(shù)，計算其平均值作為細胞轉(zhuǎn)移能力的代表。

1.1.6 宮頸癌癌細胞侵襲能力檢測

取2×105個細胞懸浮于鋪有Matrigel 50 g 的Boyden 小室的上室中，下室加有趨化劑Fibronectin 10g，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h 后，以棉簽擦盡膜上室面的細胞，HE 染色，光鏡下記數(shù)膜上5 個視野中細胞數(shù)。

1.2 在細胞中驗證miR-424 對所預測靶基因的作用

1.2.1 預測

根據(jù)targetscan、starbase、miRanda 多個數(shù)據(jù)庫的預測結(jié)果的交集，選擇參與β-catenin 信號通路有關(guān)的基因Wnt8Aa 為預測靶基因。

1.2.2 在細胞中驗證miR-424 對所預測靶基因的作用

（1）載體構(gòu)建：從人基因組 DNA 中PCR 擴增Wnt8a 3,UTR 片段，PCR 產(chǎn)物純化后，雙酶切克隆到質(zhì)粒載體，酶切鑒定正確的克隆進行測序驗證；

（2）分別將不同克隆的報告基因載體和miR-424 mimic/inhibitor 在liper3000 作用下共轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞；

（3）按照Promega 提供的熒光素酶分析檢測說明，分別對上述兩種不同轉(zhuǎn)染細胞在轉(zhuǎn)染24-48 小時后，進行熒光素酶活性檢測。

1.3 miR-424 對宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移作用機制研究

常規(guī)方法培養(yǎng)宮頸癌細胞，并在轉(zhuǎn)染前一天，取生長狀態(tài)良好的細胞用胰酶消化，細胞計數(shù)后，均勻鋪于6 孔板中(5×106/孔)。次日，當細胞達到75-80%融合時，細胞分成三組，一組導入無關(guān)序列(negative control,NC)，一組導入miR-424 inhibitor，一組不處理，為對照組；熒光倒置顯微鏡觀察照射前后細胞形態(tài)。

1.3.1 RT-PCR 檢測

提取細胞的總RNA，使其逆轉(zhuǎn)錄為c DNA 并擴增，檢測處理后細胞中Wnt8a、β-catenin 和VEGF mRNA 表達水平。

1.3.2 Western Blot 檢測

將細胞接種至6 孔板后，培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染后，將細胞刮取并離心處理，加入細胞裂解液，離心后取上清液為總蛋白，再將其煮沸變性后取30 ng 樣品，進行電泳，再加入細胞溶液孵育2 小時，凝膠成像，檢測處理后細胞中WNT8A、β-catenin 和VEGF 的蛋白表達水平。

1.3.3 細胞總RNA 的提取

用TRIzol 法提取宮頸癌細胞或?qū)m頸癌組織的總RNA,按試劑盒說明進行總RNA 提取，紫外分光光度計檢測純度：OD260/280 ≥1.8。

1.3.4 莖環(huán)法qRT-PCR 檢測miRNA

按照TaqMan miRNA 分析試劑盒（ABI PRISM）操作說明進行檢測。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用平均數(shù)±標準差()表示，采用t 檢驗分析兩組之間數(shù)據(jù)差異性，以P＜0.05 表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 miR-424 對宮頸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

利用Transwell 小室實驗檢測對細胞轉(zhuǎn)移能力進行測定結(jié)果與miR-424NC 組(22.45±3.25) 比較，miR-424inhibitor 組(3.48±0.36) 細 胞 遷移距離降低(P ＜0.010）侵襲數(shù)目，與miR-424NC組(165.78±12.15) 比較，miR-424inhibitor組(36.54±2.35)細胞侵襲數(shù)目降低(P＜0.01)。

2.2 在細胞中驗證miR-424 對所預測靶基因的作用

與miR-424 NC 組比較，miR-424 inhibitor 組VEGF mRNA 表達量下調(diào)，β-catenin 表達量下調(diào)，差異具有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

近年來越來越多的研究表明miR-424 在腫瘤組織的下調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。在大多數(shù)腫瘤中，miR-424 的表達下降，這使得細胞遷移和侵襲能力明顯升高。Chitose Oneyama 等[8]認為miR-424 的再表達抑制了腫瘤細胞的致病性和侵襲性。Xu J 等[6]通過研究147 例宮頸癌患病者同樣發(fā)現(xiàn)miR-424 低表達且與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移呈明顯負相關(guān)。同時，miR-424 與腫瘤細胞的增殖凋亡有關(guān)。Binghai Chen等[9]證明miR-424 可以通過誘導Chk1 的抑制和磷酸化，調(diào)控WEE1 和Cdc25c 磷酸化，使其表達下調(diào)進而抑制腎癌細胞的增殖，誘導凋亡。Lei Yu 等[10]也通過定量RT-PCR 分析證實了miR-424 在肝細胞癌腫瘤細胞和組織中表達下調(diào)，而其過表達降低了肝癌細胞的遷移和侵襲能力。

目前對于miR-424 抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制細胞遷移及侵襲的作用機制尚不明確，臨床有多種研究對其進行推測。有研究認為miR-424 的這種作用與其靶點c-Myb 有關(guān)。c-Myb 是一種中藥的前侵襲分子，作為miR-424 的直接靶點，該研究證明c-Myb 是miR-424 的功能下游靶點，其過表達抑制了mir -424 在肝癌細胞中的增殖和侵襲[10]。Piao L等[11]則認為miR-424 可以通過抑制YAP1 的表達而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。YAP1 是經(jīng)典Hippo-YAP 信號通路的主要效應蛋白和靶蛋白，有研究證明在腫瘤組織和細胞中其表達水平顯著增高[12]。也有研究報告認為miRNA 對于細胞的作用，是通過參與Wnt/β-catenin 信號通路作用于靶基因從而影響腫瘤細胞的增殖遷移，但仍需高質(zhì)量數(shù)據(jù)進一步證明[8]。

依據(jù)上述理論，我們猜測miR-424 可能通過調(diào)控Wnt 蛋白（Wnt8A）的表達負調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路，從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，在本研究中，首先設計出了技術(shù)流程路線（見圖1），并一一驗證。結(jié)果表明，miR-424 inhibitor 組細胞侵襲數(shù)目降低、VEGF mRNA表達量下調(diào)、β-catenin表達量下調(diào)(P＜0.01)。與設想相符。綜上所述，我們初步認為miR-424 對腫瘤細胞遷移及增殖的作用機制可能通過抑制WNT8A 表達，阻斷wnt/β-catenin信號通路，進一步通過抑制VEGF 表達抑制惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。