杜紅旗, 徐照學(xué), 房衛(wèi)平, 馮長(zhǎng)松*, 婁治國(guó), 袁華祎

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 河南 鄭州， 450008； 2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州， 450008；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所， 河南 鄭州， 450008)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上廣泛種植和利用的多年生優(yōu)良豆科牧草，在其栽培和品種選育中考慮的首要指標(biāo)是秋眠性。秋眠性是指夏末秋季由于日照長(zhǎng)度縮短和溫度下降，紫花苜蓿植株表現(xiàn)為緩慢匍匐生長(zhǎng)或停止生長(zhǎng)的一種特性。根據(jù)苜蓿秋眠特定時(shí)期刈割后植株的再生高度，將其分為秋眠型苜蓿(秋眠1-3級(jí))、半秋眠型苜蓿(秋眠4-6級(jí))和非秋眠型苜蓿(秋眠7-9級(jí))[1-2]，后來(lái)又?jǐn)U展到 11 個(gè)秋眠級(jí)別(10-11 級(jí))，包括 2個(gè)極不秋眠苜蓿[3]。秋季時(shí)秋眠型苜蓿品種生長(zhǎng)緩慢、葉小和莖纖細(xì)，但具有較強(qiáng)的抗寒性和高的越冬率；相反，非秋眠型苜蓿依然生長(zhǎng)旺盛，但抗寒性差[4-5]；半秋眠型苜蓿介于2者之間。

目前，國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為調(diào)控紫花苜蓿秋眠性的主要環(huán)境因子是光周期和溫度[6-7]，其中光周期是誘導(dǎo)苜蓿秋眠的關(guān)鍵因子[8]。國(guó)外對(duì)不同季節(jié)不同秋眠類型苜蓿根系的生長(zhǎng)狀態(tài)、根系和根頸可溶性糖的積累，以及根和芽氮素化合物的分解代謝進(jìn)行了大量研究[9-13]，并且2000年Douglas等人確定了控制秋眠型苜蓿秋季生長(zhǎng)的基因組區(qū)域，但是該區(qū)域具體的核苷酸序列未知[14]。國(guó)內(nèi)對(duì)苜蓿品種的遺傳多樣性、秋眠性與抗寒性關(guān)系、秋眠性與生產(chǎn)性能的關(guān)系等方面進(jìn)行了較多的研究[15-17]，認(rèn)為光敏色素、隱花色素2B、脫落酸，生長(zhǎng)素等可能參與秋眠性的調(diào)控[18-20]。王成章、杜紅旗等應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)得到了大量的調(diào)控苜蓿秋眠的候選基因、蛋白和microRNAs，并且選出了重要候選調(diào)控基因和蛋白[21-24]。但是這些僅僅停留在調(diào)控秋眠性候選基因和蛋白的篩選階段，并未真正確定調(diào)控苜蓿秋眠性的基因。

前期應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選調(diào)控苜蓿秋眠性關(guān)鍵基因時(shí)發(fā)現(xiàn)單銅氧化酶樣蛋白SKU5基因(SKU5)在秋眠型苜蓿Maverick葉片中秋眠時(shí)期的表達(dá)量顯著高于未秋眠時(shí)的表達(dá)量[23]，因此推測(cè)它可能調(diào)控苜蓿的秋眠性。單銅氧化酶樣蛋白SKU5屬于植物多銅氧化酶亞家族成員SKS蛋白，SKS家族蛋白是植物多銅氧化酶基因家族中存在的一類特別的亞家族,均屬于定位在細(xì)胞質(zhì)膜上的糖基化蛋白。它們只包含多銅氧化酶中保守的T2Cu連接位點(diǎn)而缺乏其他類型銅離子連接所需的組氨酸殘基，其可能已經(jīng)不具備正常的多銅氧化酶功能，而是以一種新的方式作用于植物生長(zhǎng)發(fā)育，但是這一領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)幾乎是空白，目前唯一確定的是，這種變異并不是偶然的，對(duì)于植物機(jī)體來(lái)說(shuō)，這種新型的多銅氧化酶一定有著不可取代的生理功能，這些都需要更加深入探索[25]。目前，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了SKS蛋白家族單銅氧化酶樣蛋白SKU5和SKS1-SKS18共19個(gè)成員，在油菜、煙草、玉米、報(bào)春花等植物中也發(fā)現(xiàn)了該類蛋白。SKS家族基因編碼的蛋白質(zhì)在植物根生長(zhǎng)方向、葉脈形式、花粉發(fā)育、花粉管伸長(zhǎng)、激素調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程中均具有作用，但是整個(gè)SKS基因家族的研究只集中在少數(shù)基因上[26-31]。

Sedbrook等最先從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中得到了SKS家族成員基因SKU5。SKU5全長(zhǎng)為3.3Kb，包含9個(gè)外顯子，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 764 bp，預(yù)期編碼一個(gè)定位在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁上的大小為66kDa的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于多銅氧化酶中的AAO和漆酶。雖然單銅氧化酶樣蛋白SKU5與這2種酶相似，但是它缺乏T1Cu和T3Cu所需的組氨酸殘基。SKU5在擬南芥各組織中均有表達(dá)，而在根尖分生組織和末梢伸長(zhǎng)組織中表達(dá)量最大。SKU5過(guò)表達(dá)植株在瓊脂糖上生長(zhǎng)時(shí)，根和下胚軸與野生型相比較短15%，根偏離了正常的向下生長(zhǎng)，并且與黃化的下胚軸都顯示出逆時(shí)針的軸向旋轉(zhuǎn)，打亂了根系的正常向下生長(zhǎng)[27]。但是目前苜蓿SKU5的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)檢測(cè)春夏秋季和人工條件下不同光照時(shí)間或溫度下秋眠型苜蓿品種Maverick和非秋眠型苜蓿品種Cuf101葉片中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量及分析其與苜蓿株高、葉面積、日照長(zhǎng)度、溫度的相關(guān)性來(lái)研究它在苜蓿秋眠中的作用。本研究為闡明苜蓿秋眠性分子機(jī)理提供了新的內(nèi)容、豐富了苜蓿秋眠性理論，也為苜蓿分子育種提供功能基因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、株高和葉面積檢測(cè)并記錄日照長(zhǎng)度和溫度

試驗(yàn)材料為美國(guó)苜蓿標(biāo)準(zhǔn)秋眠1級(jí)品種Maverick和秋眠9級(jí)品種Cuf101。2011年4月份到10月份期間測(cè)株高、葉面積，記錄日照長(zhǎng)度、溫度并取樣。具體操作是：每次刈割后第14天上午8:00采集各品種至少三株苜蓿植株的葉片，取每個(gè)分枝頂端第一個(gè)成熟葉片以下的第3—5片成熟葉片，取后立刻保存在液氮中，之后存于-80℃冰箱待用，同時(shí)記錄每個(gè)月的日照長(zhǎng)度和溫度。每一苜蓿品種隨機(jī)選取5株，每株隨機(jī)選取10片葉片測(cè)長(zhǎng)和寬，應(yīng)用A=KLW (A：葉面積leave area；K：修正系數(shù)coefficient of correction；L：葉長(zhǎng)Leave length；W：葉寬leave wide)公式計(jì)算葉面積[32]。每次取樣時(shí)每一苜蓿品種隨機(jī)選取15株，每株測(cè)高、中、低枝條高度取平均值作為該苜蓿株的株高。

Maverick和Cuf101苜蓿在人工氣候箱中不同光照時(shí)間或不同溫度下培養(yǎng)處理。每種苜蓿各3組，每組各3株苜蓿植株，分別在每天8 h，12 h和16 h的光照時(shí)間培養(yǎng)，溫度均為24℃、光照強(qiáng)度均為3 000 lux。每種苜蓿另外各3組，每組各3株苜蓿植株，分別在16℃,24℃和 32℃下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度均為3 000 lux、每天光照時(shí)間均為16 h。每種處理均是刈割后開(kāi)始處理，處理14d后取各自的葉片并儲(chǔ)存于-80℃冰箱待用。

1.2 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

嚴(yán)格按照TRizol法提取總RNA的操作步驟提取各樣品的總RNA(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，應(yīng)用Nano2000核酸檢測(cè)儀器(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA,USA)檢測(cè)各樣品RNA的濃度，并調(diào)至同一濃度，嚴(yán)格按照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)上操作步驟對(duì)各樣品的總RNA反轉(zhuǎn)錄。

1.3 各樣品中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的SKU5部分序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)進(jìn)行基因注釋、保守序列分析和各外顯子界限的分析，根據(jù)序列分析結(jié)果和紫花苜蓿GAPDH基因序列應(yīng)用primer5.0軟件按照熒光定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)SKU5和GAPDH的熒光定量引物(SKU5-S：GGAACACCAAGAGGAGAAGCA，SKU5-A：TTTTCATCCTCAACATTGCTCTG；GAPDH-S：TGGGAAGCACATTACAGCAG，GAPDH-A：CATCAGCATTGACACCAACC)，在羅氏Cycler9.0熒光PCR儀上應(yīng)用羅氏SYBER green熒光染料檢測(cè)各樣品中SKU5mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用2-ΔΔCt公式計(jì)算SKU5mRNA相對(duì)表達(dá)量，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示[33]。應(yīng)用SPSS 19.0(IBM Corp.,USA)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用one-way ANOVA方法分析各樣品間SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性，并應(yīng)用雙因子相關(guān)性分析和雙邊T檢驗(yàn)方法分析SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量、日照長(zhǎng)度、溫度、株高和葉面積之間的相關(guān)性。最后，應(yīng)用GraphPad prism 5 (GraphPad Software,Inc.,USA)軟件對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行線型圖的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣時(shí)期日照長(zhǎng)度和溫度

從4月份至10月份，日照長(zhǎng)度和溫度的變化趨勢(shì)均先升高后降低。從4月份至6月份的夏至，日照長(zhǎng)度逐漸延長(zhǎng)，其中夏至日最長(zhǎng)；從6月份夏至日始至10月份，日照長(zhǎng)度逐漸縮短；從4月份至10月份，溫度先升高后逐漸下降，其中7月份最高(圖1)。

圖1 4—10月份的日照長(zhǎng)度和平均溫度Fig.1 Daylength and average temperature from April to October

2.2 采樣時(shí)2種苜蓿株高和葉面積

5月份至10月份，Maverick品種的株高逐漸下降，4—8月份Maverick苜蓿株高兩兩差異不顯著，9，10月份株高極顯著低于4—8月份的株高(P< 0.01)，表明Maverick品種苜蓿在秋季發(fā)生秋眠；Cuf101株高4—10月份之間差異不顯著，但6—9月份株高有下降的趨勢(shì)，7—10月份Cuf101苜蓿株高兩兩月份之間差異不顯著；但是Cuf101苜蓿的株高顯著高于對(duì)應(yīng)月份Maverick苜蓿的株高(P<0.05)，表明Cuf101苜蓿在秋季不發(fā)生秋眠(圖2)。

Maverick苜蓿葉面積小于Cuf101苜蓿葉面積。8，9和10月份Maverick苜蓿葉面積極顯著小于Cuf101苜蓿葉面積(P< 0.01)；8，9和10月份Maverick苜蓿葉面積顯著小于其它時(shí)期葉面積(P<0.05)；Cuf101苜蓿葉面積各月份之間差異不顯著,表明秋季Maverick苜蓿秋眠時(shí)的葉面積顯著變小(圖3)。

2.3 SKU5基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3.1自然條件下SKU5基因mRNA相對(duì)表達(dá)量 自然條件下，從4月份至10月份秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)；非秋眠型苜蓿Cuf101葉中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈升高、降低、升高、降低的趨勢(shì)；秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量在9月份最高，秋季時(shí)的相對(duì)表達(dá)量顯著高于春夏季時(shí)的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量在8月份最高，之后SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量急劇降低(圖4)。結(jié)果表明：秋季時(shí)2種苜蓿葉中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量變化存在差異；秋眠型苜蓿Maverick葉中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量在秋眠時(shí)期的量高于未秋眠時(shí)期的量和秋季時(shí)非秋眠型Cuf101葉片中的量。

圖2 4—10月份2種苜蓿株高Fig.2 Plant height of Maverick and Cuf101 varieties from April to October注：**代表Maverick苜蓿9，10月份株高極顯著低于4月份時(shí)的株高(P < 0.01)；#代表7，8月份Maverick苜蓿株高顯著低于Cuf101株高(P< 0.05)，##代表9，10月份Maverick苜蓿株高極顯著低于Cuf101株高(P < 0.01)Note:** indicates that plant height of Maverick at September and October is very significant lower than that at April at the 0.01 level;# indicates that plant height of Maverick is significant lower than that of Cuf101 at July and August at the 0.05 level;## indicates that plant height of Maverick is very significant lower than that of Cuf101 at September and October at the 0.01 level

圖3 兩品種苜蓿4—10月份葉面積Fig.3 Leaf area of Maverick and Cuf101 varieties from April to October注：##代表8、9、10月份Maverick苜蓿葉面積極顯著小于8，9，10月份Cuf101的葉面積(P<0.01)，**代表9、10月份Maverick苜蓿葉面積極顯著小于其4-7月份時(shí)的葉面積(P<0.01)，*代表8月份 Maverick苜蓿葉面積顯著小于其4-7月份時(shí)的葉面積(P<0.05)Note: ## indicates that leaf area of Maverick is very significant smaller than that of Cuf101 at August, September and October at the 0.01 level, ** indicates that leaf area of Maverick at September and October is very significant smaller than that at April to July at the 0.01 level, * indicates that leaf area of Maverick at August is significant smaller than that at April to July at the 0.05 level

2.3.2人工氣候條件下SKU5基因mRNA相對(duì)表達(dá)量 人工氣候條件下，隨著日照長(zhǎng)度延長(zhǎng)，2種苜蓿葉片中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸減少,其中8h日照長(zhǎng)度時(shí)的量顯著高于12h和16h時(shí)的量(P< 0.05)；秋眠型苜蓿品種Maverick葉片中的量極顯著高于非秋眠型苜蓿品種Cuf101葉片中的量(P< 0.01)(圖5)。

圖4 4—10月份2種苜蓿葉中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.4 mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties from April to October注：**代表7,8,9,10月份時(shí)的SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于4月份時(shí)的相對(duì)表達(dá)量Note:** indicate that SKU5 mRNA relative abundance in two varieties alfalfa at July,August,September,October is very significant more than that at April at the 0.01 level

圖5 不同日照長(zhǎng)度下兩品種苜蓿真葉中SKU5mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.5 mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties grown under 8h to 16h daylength and artificial growth conditions注：* 代表8 h下每一品種苜蓿葉片SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于12 h和16 h下的相對(duì)表達(dá)量；##代表Maverick苜蓿SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于Cuf101苜蓿中的相對(duì)表達(dá)量Note:* indicates that the mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties under 8 h illumination is significant more than that 12 h,and 16 h of illumination at the 0.05 level;## indicate that the mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick leaves is very significant more than that in Cuf101 leaves at the 0.01 level

隨著溫度的升高，苜蓿葉片中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增加,其中16℃時(shí)的量極顯著低于24℃和32℃時(shí)的量(P< 0.01),Maverick葉片中的量極顯著高于Cuf101葉片中的量(P< 0.01)(圖6)。結(jié)果表明：人工氣候條件下，秋眠型苜蓿Maverick和非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5的表達(dá)受光周期和溫度的調(diào)控規(guī)律一致，但是2種苜蓿品種葉片中SKU5基因的轉(zhuǎn)錄受日照長(zhǎng)度和溫度調(diào)控趨勢(shì)相反。

圖6 人工條件下不同溫度處理的兩品種苜蓿葉中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.6 mRNA abundance of SKU5 in Maverick and Cuf101 varieties grown under artificial growth conditions at different temperatures (from 16℃ to32℃)注：** 代表16℃下每一品種苜蓿葉片SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于24℃和32℃下的相對(duì)表達(dá)量；##代表Maverick苜蓿SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于Cuf101苜蓿中的相對(duì)表達(dá)量Note:** indicate that the mRNA relative abundance of SKU5 in both varieties at 16℃ is very significant less than that 24℃and 32℃at the 0.01 level;## indicate that the mRNA relative abundance of SKU5 in Maverick leaves isvery significant more than that in Cuf101 leaves at 16℃,24℃ and 32℃ at the 0.01 level

2.4 SKU5mRNA相對(duì)表達(dá)量、苜蓿葉面積、株高、日照長(zhǎng)度、溫度之間的相關(guān)性

自然條件下,SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與日照長(zhǎng)度、溫度沒(méi)有顯著相關(guān)性(表1)；但是在人工氣候條件下,SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與日照長(zhǎng)度極顯著負(fù)相關(guān)、與溫度極顯著正相關(guān)；日照長(zhǎng)度和溫度對(duì)SKU5表達(dá)的調(diào)控趨勢(shì)相反(表2)。

表1 自然條件下SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與日照長(zhǎng)度、溫度相關(guān)性Table 1 Correlation between SKU5 mRNA relative abundance in the leaves of two varieties and daylength,temperature under natural environment

表2 人工條件下SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與日照長(zhǎng)度、溫度相關(guān)性Table 2 Correlation between SKU5 mRNA relative abundance in the leaves of two varieties and daylength,temperature under artificial growth conditions

注：** 代表差異極顯著(P<0.01)

Note:** indicate significant correlation at the 0.01 level

自然條件下，日照長(zhǎng)度、溫度與2種苜蓿株高無(wú)顯著相關(guān)性，但日照長(zhǎng)度與2種苜蓿株高相關(guān)性更高，與秋眠型苜蓿Maverick株高的相關(guān)性和顯著性高于與非秋眠型苜蓿Cuf101的相關(guān)性和顯著性(表3)。

表3 日照長(zhǎng)度、溫度與2種苜蓿株高相關(guān)性Table 3 Correlation between daylength,temperature and the plant height of two varieties

自然條件下，秋眠型苜蓿Maverick葉中SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與葉面積、株高呈顯著負(fù)相關(guān)；而非秋眠型苜蓿Cuf101葉中的相對(duì)表達(dá)量與葉面積、株高無(wú)顯著相關(guān)(表4)。

表4 SKU5 mRNA相對(duì)表達(dá)量與株高、葉面積相關(guān)性Table 4 Correlation between SKU5 mRNA relative abundance in the leaves of two varieties and plant height,leaf area

注：* 代表差異顯著(P<0.05)

Note:* indicates significant correlation at the 0.05 level

以上結(jié)果表明：在日照長(zhǎng)度與溫度共同作用的自然條件下，隨著秋眠型苜蓿Maverick葉片中的SKU5基因可能通過(guò)上調(diào)其表達(dá)抑制葉片和植株的生長(zhǎng)；非秋眠型苜蓿Cuf101SKU5基因影響其葉片和植株的生長(zhǎng)不顯著。

3 討論

不同秋眠型苜蓿在不同季節(jié)生長(zhǎng)表現(xiàn)差異，特別是在秋季生長(zhǎng)表現(xiàn)顯著差異并用秋眠的程度來(lái)衡量，但是目前苜蓿秋眠的發(fā)生機(jī)理不清楚。本研究表明：秋眠型苜蓿Maverick和非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度極顯著負(fù)調(diào)控、受溫度極顯著正調(diào)控，但自然條件下，秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因的表達(dá)主要受日照長(zhǎng)度的調(diào)控，非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達(dá)主要受溫度的調(diào)控；秋眠型苜蓿MaverickSKU5基因的高表達(dá)減小其葉面積、降低其株高從而促進(jìn)其秋眠，而非秋眠型苜蓿Cuf101SKU5基因的表達(dá)高低對(duì)其葉面積和株高變化的影響不明顯。

3.1 兩種秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度調(diào)控能力不同

在人工條件下2種秋眠型苜蓿SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度調(diào)控的趨勢(shì)均相反，日照長(zhǎng)度負(fù)調(diào)控SKU5基因的表達(dá)(表1)，日照長(zhǎng)度的縮短促進(jìn)SKU5基因的表達(dá)、溫度的降低減少其表達(dá)；在自然條件下該基因的表達(dá)是受日照長(zhǎng)度和溫度雙因子共同作用的結(jié)果，因此得不到自然條件下SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度的調(diào)控(圖4)。對(duì)于秋眠型苜蓿Maverick，從6月份開(kāi)始隨著日照長(zhǎng)度的縮短SKU5基因的相對(duì)表達(dá)量增加，從7月份起溫度的降低并未改變SKU5基因表達(dá)增加的趨勢(shì)，因此秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因的表達(dá)主要受日照長(zhǎng)度的調(diào)控。從非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達(dá)整體上看，高溫時(shí)非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的相對(duì)表達(dá)量高于低溫時(shí)的相對(duì)表達(dá)量，隨著溫度的降低其相對(duì)表達(dá)量減少，但從8月份，隨著日照長(zhǎng)度的縮短非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的相對(duì)表達(dá)量并未增加，因此非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因的表達(dá)主要受溫度的調(diào)控。秋眠型苜蓿最初引自寒冷氣候地區(qū)、具有很好的抗寒性，適合于寒冷氣候的地區(qū)生長(zhǎng)；而非秋眠型苜蓿引自冬季溫度溫和的地區(qū)，適合于熱帶地區(qū)生長(zhǎng)；它們形成了各自獨(dú)有適應(yīng)環(huán)境的調(diào)控方式[1]，并且秋眠型苜蓿與非秋眠型苜蓿的遺傳背景和遺傳多樣性不同[34-35]。因此，由于環(huán)境因子的變化，各自調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理和結(jié)果表現(xiàn)出大的差異，這可能就是導(dǎo)致本研究中兩種秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度調(diào)控能力不同的原因。

在自然條件下，4—10月份2種苜蓿SKU5基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，但也有差別，最大的差別是秋季時(shí)二者SKU5基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化不一致，秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因mRNA相對(duì)表達(dá)量在9月份達(dá)到最高，10月份緩慢減少，而非秋眠型苜蓿Cuf101葉片中SKU5基因mRNA相對(duì)表達(dá)量在8月份達(dá)到最高，9，10月份迅速降低(圖4)，在這個(gè)時(shí)期秋眠型苜蓿發(fā)生秋眠，非秋眠型苜蓿不發(fā)生秋眠。因此我們推測(cè)：2種苜蓿中SKU5基因表達(dá)的差異在秋季它們生長(zhǎng)表現(xiàn)差異中起著重要的作用，在秋季它的高表達(dá)促進(jìn)了秋眠型苜蓿的秋眠、低表達(dá)維持了非秋眠型苜蓿的正常生長(zhǎng)。SKU5基因的過(guò)表達(dá)擬南芥相對(duì)于野生型植株其根和下胚軸變短[27],此結(jié)果與本研究的結(jié)果相似。

3.2 SKU5基因調(diào)控苜蓿秋眠性機(jī)理

葉面積是苜蓿秋眠性的一個(gè)重要指標(biāo)[21，36]。它是葉片細(xì)胞周期、分裂和生長(zhǎng)的宏觀表現(xiàn),細(xì)胞周期調(diào)節(jié)與整個(gè)器官生長(zhǎng)速率的變化有著直接的聯(lián)系,細(xì)胞周期、分裂和生長(zhǎng)受細(xì)胞和環(huán)境因素之間空間關(guān)系的調(diào)節(jié)[37-38]，葉片大小受細(xì)胞周期、分裂和生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)變異的影響[39]，有研究表明單銅氧化酶樣蛋白SKU5與細(xì)胞周期、分裂和生長(zhǎng)均有關(guān)[27]。

日照長(zhǎng)度是調(diào)控苜蓿秋眠性的關(guān)鍵環(huán)境因子[16-17]，從夏季至秋季隨著日照長(zhǎng)度的縮短秋眠型苜蓿發(fā)生秋眠。本研究表明SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度的調(diào)控，其中秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因的表達(dá)主要受日照長(zhǎng)度的調(diào)控，日照長(zhǎng)度的縮短導(dǎo)致秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達(dá)量升高(圖4)，而且秋眠型苜蓿Maverick葉片中SKU5基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量與其葉面積和株高顯著負(fù)相關(guān)，SKU5基因的高表達(dá)減少了葉面積、降低了株高(圖2-4，表4)，秋季時(shí)秋眠型苜蓿發(fā)生秋眠。因此，隨著日照長(zhǎng)度的縮短，SKU5基因的高表達(dá)很可能促進(jìn)了秋眠型苜蓿的秋眠。

眾所周知,葉的光合作用、呼吸作用和蒸騰作用對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的作用。銅是蛋白質(zhì)的重要輔助因子，參與呼吸代謝中的氧化還原反應(yīng)，葉綠體質(zhì)體藍(lán)素中銅參與光合作用的電子傳遞過(guò)程[40]，所以銅含量的減少會(huì)降低葉片光合作用效率。單銅氧化酶樣蛋白SKU5基因的高表達(dá)會(huì)與葉綠體質(zhì)體藍(lán)素競(jìng)爭(zhēng)銅而導(dǎo)致葉綠體質(zhì)體藍(lán)素能結(jié)合的銅相對(duì)減少?gòu)亩档凸夂献饔茫M(jìn)而抑制了植物的生長(zhǎng)。另外，有研究表明：?jiǎn)毋~氧化酶樣蛋白SKU5可能通過(guò)參與細(xì)胞壁的膨脹來(lái)參與2個(gè)方向的定向生長(zhǎng)過(guò)程[27]。因此，SKU5調(diào)控秋眠型苜蓿秋眠的機(jī)理可能是隨著日照長(zhǎng)度的縮短導(dǎo)致了它的高表達(dá)從而降低了細(xì)胞壁的膨脹,抑制了葉片2個(gè)方向的生長(zhǎng)而導(dǎo)致了葉片變小和變薄，以及降低了葉綠體質(zhì)體藍(lán)素結(jié)合的銅，最終共同減弱了葉片光合作用、呼吸作用和蒸騰作用，從而減慢了整個(gè)植株的生長(zhǎng)而發(fā)生秋眠。

4 結(jié)論

苜蓿葉片中SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度的調(diào)控，但是2種秋眠型苜蓿葉片中SKU5基因的表達(dá)受日照長(zhǎng)度和溫度的調(diào)控方式不同；對(duì)于秋眠型苜蓿，隨著日照長(zhǎng)度的縮短SKU5高表達(dá)參與調(diào)控苜蓿的秋眠。