寇江濤

(1. 宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 江西 宜春 336000； 2. 江西省作物生長發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 宜春 336000)

非生物脅迫是造成全球農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的主要因素，世界范圍內(nèi)因非生物脅迫造成的農(nóng)作物產(chǎn)量損失高達(dá)50%[1]。其中，鹽脅迫是影響作物生長和發(fā)育、限制產(chǎn)量形成的主要非生物脅迫因子之一，也是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展所面臨的嚴(yán)峻問題[2]。鹽脅迫下，植物體內(nèi)的水勢降低，鹽分離子增加，導(dǎo)致植物對水分的利用效率下降，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡遭到破壞，生長發(fā)育受到抑制[3]。研究[4]表明，鹽脅迫下，牧草種子的發(fā)芽率隨著鹽脅迫濃度的升高顯著降低，燕麥[5]種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、苗高、根長和生物量均下降，萌發(fā)和生長受到抑制，且存在濃度效應(yīng)。

油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids，BRs)是Mitchell等[6]于1970年首次在油菜(BrassicanapusL.)花粉中發(fā)現(xiàn)、篩選和分離得到，被稱為第六大植物激素，對于植物的生長發(fā)育具有不可或缺的作用。研究[7-10]表明，正常條件或逆境脅迫下，適宜濃度的BRs處理，均可促進(jìn)植物種子下胚軸的伸長，提高植物種子的發(fā)芽率。鹽脅迫下，適宜濃度的BRs能夠促進(jìn)水稻(OryzasativaL.)[11]、小麥(TriticumaestivumL.)[12]、黃瓜(CucumissativusL.)[13-14]等作物種子的萌發(fā)和幼苗生長，提高其抗鹽性。

燕麥作為一種糧飼兼用作物，具有適口性好、易于栽培和貯藏等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國高寒牧區(qū)一年生高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)人工草地建植的優(yōu)良飼草品種，也是我國半農(nóng)半牧區(qū)的優(yōu)質(zhì)作物品種，在我國北方高寒牧區(qū)和農(nóng)牧交錯區(qū)畜牧業(yè)穩(wěn)定發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。因此，探尋減緩鹽脅迫對燕麥傷害的有效途徑，不管是對于燕麥種子萌發(fā)和植株生長，還是對其干草生產(chǎn)均具有重要意義。本研究以‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥為材料，研究不同濃度2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)對100 mmol·L-1NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)的影響，旨在探討鹽脅迫下外源BRs對燕麥種子萌發(fā)的調(diào)控機(jī)制，為尋求減緩鹽脅迫對燕麥傷害的有效途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為‘加燕2號’(AvenasativaL.‘Jiayan 2’)和‘青引2號’(AvenasativaL.‘Qingyin 2’)燕麥。2,4-表油菜素內(nèi)酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)為分析純(美國Sigma公司，Ruibio分裝)。

1.2 材料處理

選取飽滿、均勻、大小一致的供試燕麥種子，用0.1% HgCl2溶液消毒5 min，去離子水沖洗5～6次，吸水紙吸干后置于墊有2層定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿100粒種子，將各處理培養(yǎng)皿置于種子發(fā)芽箱中進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽箱中的光通量密度為70 μmol·m-2·s-1，溫度為25℃± 1℃，相對濕度為80%左右。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100 mmol·L-1NaCl脅迫對燕麥種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制率均達(dá)到50%左右，對于燕麥而言適于中度鹽脅迫，因此本試驗(yàn)選擇的NaCl脅迫濃度為100 mmol·L-1。本試驗(yàn)設(shè)8個處理，分別為：對照(CK):蒸餾水，T0：100 mmol·L-1NaCl，T1：100 mmol·L-1NaCl + 10-5μmol·L-1EBR，T2：100 mmol·L-1NaCl + 10-4μmol·L-1EBR，T3：100 mmol·L-1NaCl + 10-3μmol·L-1EBR，T4：100 mmol·L-1NaCl +0.01 μmol·L-1EBR，T5：100 mmol·L-1NaCl +0.10 μmol·L-1EBR，T6：100 mmol·L-1NaCl+1 μmol·L-1EBR，每個處理6次重復(fù)。各處理培養(yǎng)皿中分別添加含相應(yīng)濃度EBR的100 mmol·L-1NaCl溶液5 mL，CK添加 5 mL蒸餾水。為保證燕麥發(fā)芽過程中處理液濃度穩(wěn)定，每24 h更換1次處理液。

1.4 指標(biāo)測定

從燕麥種子發(fā)芽之日起，每天觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，其中發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別以4 d和10 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

試驗(yàn)處理第4 d時，取樣測定燕麥種子的淀粉酶、蛋白水解酶活性及淀粉、可溶性蛋白、游離氨基酸含量，其中α-淀粉酶、β-淀粉酶活性和游離氨基酸含量參照鄒琦[15]的方法測定，蛋白水解酶活性參照張志剛等[16]的方法測定，淀粉和可溶性蛋白含量參照張志良[17]的方法測定。

試驗(yàn)處理第10 d時，取樣測定燕麥幼苗的苗高、根長、幼苗干重和根系活力，其中根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[15]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，采用SPSS 16.0用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，其中發(fā)芽勢、發(fā)芽率數(shù)據(jù)作反正弦轉(zhuǎn)換之后進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

由圖1可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均顯著降低(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發(fā)芽勢分別降低70.42%和60.18%，發(fā)芽率分別降低44.19%和55.95%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了燕麥種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率(P<0.05)，其中以T4和T5處理最高，說明0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1EBR的處理效果較好。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發(fā)芽勢分別提高214.29%和133.33%，發(fā)芽率分別提高50.00%和86.49%；T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發(fā)芽勢分別提高195.25%和141.67%，發(fā)芽率分別提高47.92%和91.89%。

圖1 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of EBR on the germination potential and germination rate of oat seed under NaCl stress注：圖中不同字母表示各處理之間差異顯著(P<0.05)Note:Different letters mean significant difference at 0.05 level

由表1可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫顯著降低了燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根系活力(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發(fā)芽指數(shù)分別降低66.20%和68.21%，活力指數(shù)分別降低80.07%和82.20%，根系活力分別降低55.11%和53.42%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了燕麥種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根系活力(P<0.05)，其中以T4和T5處理最高，說明0.01 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1EBR的處理效果較好。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發(fā)芽指數(shù)分別提高178.13%和182.59%，活力指數(shù)分別提高333.75%和340.58%，根系活力分別提高54.93%和75.82%；T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的發(fā)芽指數(shù)分別提高162.16%和183.19%，活力指數(shù)分別提高313.10%和339.21%，根系活力分別提高54.49%和77.75%。

由表2可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥幼苗的生長顯著受到抑制，苗高、根長和幼苗干重顯著降低(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的苗高分別降低53.89%和68.24%，根長分別降低68.12%和65.28%，幼苗干重分別降低41.05%和44.03%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了燕麥種子的苗高、根長和幼苗干重(P<0.05)，其中以T4和T5處理最高，說明0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1EBR的處理效果較好。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的苗高分別提高52.67%和105.78%，根長分別提高83.64%和88.99%，幼苗干重分別提高55.95%和55.91%；T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的苗高分別提高63.79%和99.39%，根長分別提高124.24%和84.59%，幼苗干重分別提高57.58%和55.09%。

表1 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和根系活力的影響Table 1 Effects of EBR on the germination index,vigor index and root vigor of oat seed under NaCl stress

注：同列數(shù)值后不同字母表示各處理之間差異顯著(P<0.05)，下表同

Note:Values followed by different letters in the same column indicate significant at 5% level,the same as following tables

2.2 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶和蛋白水解酶活性的影響

由表3可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)，蛋白水解酶活性顯著升高(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的α-淀粉酶活性分別降低43.54%和42.04%，β-淀粉酶活性分別降低38.31%和38.94%，蛋白水解酶活性分別提高67.09%和27.03%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR后，燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶活性顯著提高(P<0.05)，蛋白水解酶活性顯著降低(P<0.05)。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的α-淀粉酶活性最高，分別提高61.20%和75.35%；T4和T5處理的β-淀粉酶活性最高，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的β-淀粉酶活性分別提高55.62%和68.72%，T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的β-淀粉酶活性分別提高53.91%和63.54%；T4和T5處理的蛋白水解酶活性最低，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的蛋白水解酶活性分別降低32.23%和17.19%，T5處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的蛋白水解酶活性分別降低30.91%和17.45%。

表3 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶和蛋白水解酶活性的影響Table 3 Effects of EBR on the activity of amylase and proteolytic enzyme in the process of seeds germination under NaCl stress

2.3 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉、可溶性蛋白和游離氨基酸含量的影響

由表4可知，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，燕麥種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白含量顯著降低(P<0.05)，淀粉和游離氨基酸含量顯著升高(P<0.05)。和CK相比較，T0處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的可溶性蛋白含量分別降低46.81%和47.86%，淀粉含量分別提高37.94%和36.98%，游離氨基酸含量分別提高67.06%和74.80%。100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR后，燕麥種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白含量顯著提高(P<0.05)，淀粉和游離氨基酸含量顯著降低(P<0.05)，其中以T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的可溶性蛋白含量最高、淀粉和游離氨基酸含量最低。和T0處理相比較，T4處理下‘加燕2號’和‘青引2號’的可溶性蛋白含量分別提高68.87%和61.92%，淀粉含量分別降低24.24%和22.74%，游離氨基酸含量分別降低30.79%和34.20%。

表4 外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉、可溶性蛋白和游離氨基酸含量的影響Table 4 Effects of EBR on the content of starch,soluble protein and free amino acid in the process of seeds germination under NaCl stress

3 討論

種子萌發(fā)是植物生命活動的開始，是植物生長發(fā)育的前提，也是植物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。鹽脅迫作為限制植物種子萌發(fā)的主要非生態(tài)因子，其對植物所造成的直接傷害表現(xiàn)為種子萌發(fā)受到抑制，萌發(fā)時間延長，發(fā)芽率和發(fā)芽勢降低，導(dǎo)致幼苗和根系生長緩慢，生物量下降[18-22]。BRs雖然不是種子萌發(fā)的必要條件，但其可以通過生化機(jī)理調(diào)節(jié)和不同的信號途徑來調(diào)控植物種子的休眠和萌發(fā)[23]，能夠打破種子休眠，提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)細(xì)胞分裂和下胚軸的伸長，促進(jìn)側(cè)根生長發(fā)育和植物幼苗生長，提高植物的抗逆性[7,24]，因此其與種子萌發(fā)和休眠的關(guān)系也成為逆境下種子生理生化研究的熱點(diǎn)。本研究中，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子的萌發(fā)顯著被抑制，添加外源EBR顯著緩解了NaCl脅迫對燕麥種子萌發(fā)的抑制作用，提高了‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，并促進(jìn)了燕麥幼苗和根系的生長，提高了根系活力和幼苗干重。說明外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子的萌發(fā)具有正向調(diào)控作用，而且存在顯著的濃度效應(yīng)，以0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)抑制的緩解效果最佳，這與賈洪濤等[12]、吳雪霞等[9]、張紅[25]、Shu等[26]對鹽脅迫下外源BRs調(diào)控小麥、茄子(SolanummelongenaL.)、玉米(ZeamaysL.)和棉花(GossypiumhirsutumL.)種子萌發(fā)和幼苗生長的研究結(jié)果一致。

植物種子萌發(fā)的最初階段，其所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源主要來自貯存物質(zhì)的氧化分解，在淀粉酶和蛋白水解酶的催化作用下，種子中的淀粉和貯藏蛋白氧化分解釋放能量，并為胚的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。研究[27]表明，鹽脅迫下植物種子萌發(fā)過程中的物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂，并產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害作用，過量的鹽分離子能夠降低淀粉酶和蛋白水解酶的活性，抑制淀粉和可溶性蛋白的水解，從而抑制種子的萌發(fā)；但低濃度的鹽脅迫對植物種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，可能是由于低濃度的鹽分離子能夠提高淀粉酶活性，促進(jìn)淀粉的水解[28]。本研究中，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性顯著降低，淀粉水解被抑制，蛋白水解酶活性顯著升高，可溶性蛋白大量水解，游離氨基酸含量顯著提高，說明NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)其所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源主要來自可溶性蛋白的水解，而淀粉的水解供能被抑制。

研究[29-31]表明，外源BRs可以調(diào)控植物種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶的活性，促進(jìn)淀粉水解供能，還可以調(diào)控植物細(xì)胞的伸長和分裂，促進(jìn)植物種子下胚軸的伸長，在促進(jìn)種子萌發(fā)的過程中和其他激素具有協(xié)同作用。本研究中，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，添加外源EBR顯著提高了‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子萌發(fā)過程中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，促進(jìn)淀粉水解供能，并降低了蛋白水解酶活性，有效抑制可溶性蛋白水解和游離氨基酸的積累，說明外源EBR能夠通過調(diào)控NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)過程中淀粉酶和蛋白水解酶的活性，來促進(jìn)燕麥種子糊粉層中不溶性糖轉(zhuǎn)化為可直接利用的可溶性糖，并抑制可溶性蛋白的水解，從而促進(jìn)燕麥種子的萌發(fā)，以0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)的促進(jìn)效果最好。植物種子的萌發(fā)過程是一個復(fù)雜的生理生化過程，受到很多因素的影響，在植物種子的休眠和萌發(fā)過程中，多種激素都起到調(diào)控作用，而且不同激素之間也存在直接或間接作用，對植物種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用或拮抗作用。因此，外源EBR促進(jìn)NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)的信號途徑和生化調(diào)節(jié)機(jī)理還有待進(jìn)一步作深入的研究。

4 結(jié)論

100 mmol·L-1NaCl脅迫下，‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子萌發(fā)和幼苗生長顯著受到抑制，α-淀粉酶和β-淀粉酶活性顯著降低，蛋白水解酶活性顯著提高，可溶性蛋白加速水解，游離氨基酸大量積累；添加外源EBR顯著提高了NaCl脅迫下‘加燕2號’和‘青引2號’燕麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，促進(jìn)了燕麥幼苗和根系的生長，提高了根系活力和幼苗干重，提高了燕麥種子萌發(fā)過程中的α-淀粉酶和β-淀粉酶活性，降低了蛋白水解酶活性，有效抑制可溶性蛋白水解和游離氨基酸的積累。本試驗(yàn)說明外源EBR對NaCl脅迫下燕麥種子萌發(fā)的抑制作用具有明顯的緩解效應(yīng)，且存在明顯的濃度效應(yīng)，以0.01 μmol·L-1和0.10 μmol·L-1外源EBR的處理效果最好。