龔阿瓊， 高 震， 陳敬幫， 戴晉軍， 胡駿鵬， 王學(xué)東

（1.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌443003；2.武漢輕工大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點實驗室，湖北武漢430023）

隨著飼料行業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，豆粕作為大豆加工副產(chǎn)物，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量為40% ～50%， 脂肪為1% ～2%，碳水化合物約為10% ～15%， 且較魚粉價格低，是目前廣泛使用的植物性蛋白質(zhì)飼料原料， 其需求量逐年遞增（熊智輝等，2007）。然而豆粕中含有的抗原蛋白，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等，會造成畜禽生產(chǎn)性能和飼料利用率降低， 這在一定程度上限制了其在飼料中的應(yīng)用 （朱長生等，2014）。發(fā)酵法能在一定程度上去除豆粕中的有害物質(zhì)或抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高其營養(yǎng)價值，但這會大幅度提高豆粕的使用成本（王章存等，2018）。隨著酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展和各種酶制劑產(chǎn)品的問世，為利用酶制劑解決豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子問題提供了可能性（姜倩倩等，2012）。王之盛等（2004）的體外酶解試驗表明， 蛋白酶對大豆蛋白的體外降解并不總是降低大豆蛋白生物學(xué)的致敏性， 大豆蛋白的降解具有蛋白酶特異性， 不同的蛋白酶作用于不同的大豆蛋白亞基或結(jié)構(gòu)， 并最終反映到對動物的致敏性差異上（于海濤等，2018；陳乃松等，2008；王寶海等，2005）。 因此，本文使用常見的酶制劑采用單一和復(fù)合的方法對豆粕中的相應(yīng)抗原蛋白開展試驗，測定其中抗原蛋白的水平，旨在為利用酶制劑體外處理豆粕中的抗原蛋白提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 豆粕，購自濱州萬齊飼料有限公司； 大豆球蛋白定量檢測試劑盒、β-伴大豆球蛋白定量檢測試劑盒， 購自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司。

堿性蛋白酶1 ～3，購自山東蔚藍(lán)生物科技有限公司；堿性蛋白酶4 ～6，購自寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司；堿性蛋白酶7 ～11，購自安琪酵母股份有限公司。 中性蛋白酶1 ～2，購自山東蔚藍(lán)生物科技有限公司；中性蛋白酶3 ～5，購自安琪酵母股份有限公司。 酸性蛋白酶1 ～2，購自山東蔚藍(lán)生物科技有限公司；酸性蛋白酶3 ～4，購自安琪酵母股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶解豆粕方法 根據(jù)飼料采樣GB/T14699.1-2005 對購買豆粕進(jìn)行分裝采樣， 在每個呼吸袋裝入200 g 豆粕， 按照料水比5：4 加入一定體積蒸餾水， 在25 ℃條件下再加入0.5%的酶制劑，處理24 h 后，將呼吸袋打開，濕物料攪拌均勻取樣備用，測定其中抗原蛋白含量。

1.2.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的測定ELISA 測定過程參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。 過程簡要描述如下：稱取一定質(zhì)量備用樣品（樣品需粉碎成60 目以上顆粒，0.3 g） 于50 mL 離心管中， 加入30 mL 樣品提取液，于25 ℃振蕩提取16 h，靜置2 min 后，離心5 min（4000 r/min），取上清液并稀釋70 倍。 將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品平行測定兩次， 記錄校準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置，經(jīng)過加樣、洗板、加酶標(biāo)試劑、顯色，加終止液后于450/630 nm 雙波下讀取吸光度值。 按照下列公式計算吸光率：

式中：B 為校準(zhǔn)品2 ～6 或樣品的平均吸光度值，B0為校準(zhǔn)品1 的平均吸光度值。

校準(zhǔn)曲線的繪制：以校準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以校準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 試驗設(shè)計 采用對比試驗方法，在實驗室進(jìn)行體外消化試驗： 在恒溫振蕩器上進(jìn)行反應(yīng)（37 ℃，90 min，100 r/min），反應(yīng)結(jié)束后立即瞬間高溫滅活終止酶解反應(yīng)，烘干后測定相關(guān)的抗?fàn)I養(yǎng)因子。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 抗原蛋白降解率計算公式如下：

抗原蛋白降解率/%=（對照組豆粕與酶解豆粕的差值）/對照組豆粕×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的篩選

2.1.1 堿性蛋白酶 由圖1 可知， 在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，不同堿性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的含量影響差異較大，10 號酶對兩種抗原蛋白都有效果， 對大豆球蛋白降解效果更明顯。

圖1 不同堿性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.1.2 中性蛋白酶 由圖2 可知， 在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，不同中性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的含量有一定差異性，5 號酶對大豆球蛋白降解效果優(yōu)于伴大豆球蛋白。

圖2 中性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.1.3 酸性蛋白酶 由圖3 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，不同酸性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的含量影響差異相對不大，4 號酶對伴大豆球蛋白降解效果較好。

圖3 酸性蛋白酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.2 酶添加量的選擇

2.2.1 堿性蛋白酶用量 由圖4 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度和處理時間）下，隨著堿性蛋白酶（10 號）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在堿性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來越低。 在0.7%添加量時達(dá)到最高降解率。

圖4 不同添加量的堿性蛋白酶對大豆球蛋白的降解效果

2.2.2 中性蛋白酶用量 由圖5 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度和處理時間）下，隨著中性蛋白酶（5 號）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在中性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來越低。在曲線的開始階段，斜率最大，此后逐漸減小，表明隨著中性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐漸減小。

圖5 不同添加量的中性蛋白酶對大豆球蛋白的降解效果

2.2.3 酸性蛋白酶用量 由圖6 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度和處理時間）下，隨著酸性蛋白酶（4 號）量的增加，豆粕中的β-伴大豆球蛋白降解率增大，表明在酸性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越來越低。在0.6%添加量之后逐漸減小，表明隨著酸性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐漸減小。

圖6 不同添加量的酸性蛋白酶對β-伴大豆球蛋白的降解效果

2.3 復(fù)合酶的制備 優(yōu)選10 號堿性蛋白酶、5 號中性蛋白酶和4 號酸性蛋白酶按照7:5:6 比例制備復(fù)合酶。 由圖7 可知，在相同的酶解參數(shù)（料水比、溫度、酶添加量和處理時間）下，復(fù)合酶對抗原蛋白的降解效果優(yōu)于單個酶。

圖7 不同酶對豆粕中抗原蛋白的降解效果

3 結(jié)論

豆粕是畜牧行業(yè)中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源之一，但豆粕中的抗原蛋白是普通存在的問題。 酶解法被認(rèn)為是安全有效可降低抗原蛋白的方法， 于海濤等（2018）的試驗表明，使用6 kg/t 的角蛋白酶可以降解60%的伴大豆球蛋白和37%的大豆球蛋白，本文通過篩選不同外源酶試驗，也得出不同酶制劑對豆粕中抗原蛋白有不同程度的降解作用，說明酶解法確實是去除抗原蛋白的有效方法。 推測抗原蛋白類物質(zhì)以復(fù)雜的連接方式形成復(fù)合體，單一的酶制劑難以充分破壞其結(jié)構(gòu)，因此多種酶制劑的協(xié)同作用效果可能更好， 本文也驗證了這一推測，在同樣的酶解方法下，復(fù)合酶制劑對豆粕中抗原蛋白降解效果優(yōu)于單一酶制劑。 通過抗原蛋白的降解率分析， 使用外源酶可有效提高豆粕中的蛋白消化利用率， 但是酶解法的酶解效果受酶的種類、 添加量、 酶解條件等多種因素的影響。王之盛等（2004）認(rèn)為，還需要考慮不同酸堿性條件對酶解能力的影響， 并通過試驗驗證在堿性條件下有利于豆粕抗原蛋白的降解。 因此如何有效降低或者完全去除豆粕中的抗原蛋白， 還需在酶解方法上做更深入的研究。