丁 健， 孟慶翔

（1.全國(guó)畜牧總站，北京100125；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京100094）

谷物蒸汽壓片加工技術(shù)通過(guò)提高谷物淀粉在瘤胃和全消化道的消化率， 提高了谷物的飼喂效果，在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用。但蒸氣壓片谷物淀粉糊化度的提高， 加快了其在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵速度， 對(duì)于飼喂以谷物為主的高精料日糧的肥育牛羊而言，易引發(fā)瘤胃有機(jī)酸的積累，導(dǎo)致微生物區(qū)系失調(diào)和功能紊亂， 從而提高誘發(fā)急慢性瘤胃酸中毒的可能。莫能菌素作為瘤胃調(diào)控劑，被用于穩(wěn)定反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)環(huán)境。 但由于抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移、 藥物殘留等食品安全問(wèn)題引起人們廣泛擔(dān)憂，其使用也受到限制?；钚越湍钢饕ㄟ^(guò)活酵母菌來(lái)穩(wěn)定瘤胃功能， 由于其不存在藥物殘留等問(wèn)題，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用。但酵母產(chǎn)品由于其活性及使用方法的差異，目前的研究報(bào)告顯示，其對(duì)瘤胃發(fā)酵及動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響效果不一致。 本試驗(yàn)利用活體外產(chǎn)氣法，以蒸汽壓片玉米為底物，研究比較活性酵母和莫能菌素對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響，為瘤胃調(diào)控劑在以蒸汽壓片谷物為日糧的反芻家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 蒸汽壓片玉米的制備：選取河北省本地玉米進(jìn)行蒸汽壓片處理。 壓片參數(shù)：95 ℃蒸汽調(diào)質(zhì)55 min，壓片厚度2 mm，容重390 g/L。風(fēng)干樣品通過(guò)旋風(fēng)磨粉碎機(jī)粉碎后過(guò)1 mm 米篩， 常溫保存、 備用。 活性酵母（Saccharomyces cerevisiae CNCM I-1077）由拉曼動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)公司提供（活細(xì)胞數(shù)≥2.0×1010cfu/g）。 莫能菌素由浙江海正興發(fā)獸藥有限公司提供（含量20%）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 采用Menke 等（1979）的活體外產(chǎn)氣法進(jìn)行體外試驗(yàn)。 試驗(yàn)設(shè)三個(gè)處理：（1）對(duì)照組（CK 組）；（2）活性酵母（LY 組）添加組，添加量16.7 mg/L （3.3×108cfu//L）；（3） 莫能菌素（MO組）添加組，添加量3.3 mg/L。

1.2.2 活體外培養(yǎng) 將0.2000 g 蒸汽壓片玉米放入特制的100 mL 注射器樣玻璃消化管中，試驗(yàn)組分別添加活性酵母（16.7 mg/L）和莫能霉素（3.3 mg/L），39 ℃水浴鍋預(yù)熱。 用自動(dòng)加液器向各培養(yǎng)管加入30 mL 混合培養(yǎng)液，迅速放入已預(yù)熱（39 ℃）的人工瘤胃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 分別記錄各處理組在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、56、64 和72 h 的產(chǎn)氣量，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3 個(gè)重復(fù)。 同時(shí)將各處理組進(jìn)行另一個(gè)批次3 個(gè)重復(fù)的培養(yǎng)， 測(cè)定24 h 干物質(zhì)消化率，并測(cè)定上清液中pH、VFA 和NH3-N 濃度等活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)。

1.2.3 混合培養(yǎng)液的制備 于晨飼前通過(guò)瘤胃瘺管分別采集4 頭西門塔爾雜交閹公牛的瘤胃內(nèi)容物，等體積混合后，以4 層紗布過(guò)濾，并迅速加入裝有經(jīng)CO2飽和并預(yù)熱的39 ℃緩沖液中，配制成混合培養(yǎng)液（瘤胃液與緩沖液配比為1：2）。

1.2.4 產(chǎn)氣參數(shù)計(jì)算公式

采用模型GP=B×｛1-exp［-c×（t-lag）］｝，計(jì)算動(dòng)態(tài)消化產(chǎn)氣參數(shù)；

式中：GP 為t 時(shí)間點(diǎn)0.2000 g 底物干物質(zhì)（DM）產(chǎn)氣量，mL；B 為0.2000 g 底物DM 理論最大產(chǎn)氣量，mL；c 為樣本的產(chǎn)氣速度，h-1；lag 為樣本的產(chǎn)氣延滯期，h；t 為體外培養(yǎng)時(shí)間，h。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法 pH： 發(fā)酵結(jié)束后用雷磁PHS－3C 型精密pH 計(jì)（數(shù)顯讀數(shù)精度0.01）迅速測(cè)定。

VFA 濃度：采用Varian 3420 氣相色譜儀（北京分析儀器廠）測(cè)定。 取1 mL 分離液相，加入0.2 mL 25%（W/V）偏磷酸，搖勻后冰浴超過(guò)30 min，10000 g 離心10 min，取上清液用于色譜分析。 色譜條件：PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱， 色譜柱為內(nèi)徑3 mm，長(zhǎng)2 m；載氣為氮?dú)?，流?5 mL/min，氫氣流速35 mL/min，空氣流速250 mL/min，氫焰離子檢測(cè)器，柱溫150 ℃，離子化室溫度220 ℃，靈敏度107，衰減4，進(jìn)樣量0.6 μL。

NH3-N 濃度：苯酚－次氯酸鈉比色法測(cè)定。1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件（SAS，1999）中的廣義線性模型（GLM）進(jìn)行單因子試驗(yàn)方差分析， 采用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)72 h 動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響 圖1 為添加LY 和MO 后蒸汽壓片玉米在72 h 內(nèi)的動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣曲線。 產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)擬合非線性回歸方程得出各發(fā)酵參數(shù)值見表1。 由表1 可知，與對(duì)照組相比，LY 添加顯著降低了蒸汽壓片玉米的產(chǎn)氣速度 （P ＜0.05），但對(duì)產(chǎn)氣延滯期24 h 和72 h 總產(chǎn)氣量及理論最大產(chǎn)氣量影響不顯著；添加MO 顯著提高了產(chǎn)氣速度 （P ＜0.05）， 縮短了產(chǎn)氣延滯期 （P ＜0.05），并顯著降低了24 h 和72 h 總產(chǎn)氣量及理論最大產(chǎn)氣量（P ＜0.05）。

圖1 添加活性酵母和莫能菌素后蒸汽壓片玉米72 h 的產(chǎn)氣趨勢(shì)

表1 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)蒸汽壓片玉米體外產(chǎn)氣動(dòng)態(tài)參數(shù)的影響

2.2 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)底物干物質(zhì)消化率的影響 添加LY 和MO 對(duì)蒸汽壓片玉米24 h DM 消化率無(wú)顯著影響（P ＞0.05），結(jié)果見圖2。

圖2 添加活性酵母和莫能菌素后蒸汽壓片玉米24 h DM 消化率

2.3 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)24 h 活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 從表2 可以看出， 添加LY顯著提高了發(fā)酵液NH3-N 濃度 （P ＜0.05），對(duì)VFA 組成比例無(wú)顯著影響；添加MO 顯著降低了發(fā)酵液NH3-N 濃度，乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸及異戊酸摩爾比例（P ＜0.05），顯著提高了丙酸比例（P ＜0.05），從而顯著地降低了乙：丙比（P ＜0.05）。兩者對(duì)體外瘤胃pH 和總VFA 的影響均不顯著。

表2 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)蒸汽壓片玉米活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3 討論

3.1 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)72 h 動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣量、 產(chǎn)氣參數(shù)和DM 消化率的影響 據(jù)報(bào)道，莫能菌素能選擇性抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，產(chǎn)甲烷菌被抑制導(dǎo)致瘤胃發(fā)酵甲烷的量減少，同時(shí)CO2產(chǎn)量也會(huì)有所降低，導(dǎo)致總產(chǎn)氣量減少，這與本試驗(yàn)中添加莫能菌素顯著降低了24 h 和72 h 的總產(chǎn)氣量一致。 但從試驗(yàn)結(jié)果也可以看出，試驗(yàn)中莫能菌素對(duì)產(chǎn)氣量的抑制主要體現(xiàn)在發(fā)酵12 h以后， 而在發(fā)酵前12 h 莫能菌素反而提高了產(chǎn)氣量，最終表現(xiàn)為添加莫能菌素顯著加快了產(chǎn)氣速度，并縮短了發(fā)酵底物的產(chǎn)氣延滯期。 添加活性酵母雖未對(duì)產(chǎn)氣延滯期產(chǎn)生影響，但卻顯著降低了產(chǎn)氣速度，實(shí)質(zhì)是減緩了蒸汽壓片玉米的瘤胃發(fā)酵速度。 根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，相對(duì)于莫能菌素，活性酵母對(duì)在蒸汽壓片玉米等含高快速降解碳水化合物日糧中緩解瘤胃酸中毒可能更為有效，但這一推論還有待于試驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究表明， 谷物飼料在瘤胃中發(fā)酵速度越快，其發(fā)酵程度越高。但在本次試驗(yàn)中，酵母的添加雖然降低了蒸汽壓片玉米的發(fā)酵速度， 但其24 h 累積產(chǎn)氣量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，因此并未觀察到DM 消化率的降低，反而在數(shù)值上略有升高。Miller-Webster 等（2002）發(fā)現(xiàn)，酵母或酵母培養(yǎng)物的添加，能夠增加瘤胃內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)，提高細(xì)菌活力及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃的消化率。 相反，莫能菌素雖然提高了壓片玉米的產(chǎn)氣速度，但發(fā)酵至24 h 時(shí)，瘤胃產(chǎn)氣量卻顯著降低了，因此體現(xiàn)在DM 消化率數(shù)值上反而略有降低。 有研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)中添加莫能菌素能降低飼料DM 的消化率，谷物類型也會(huì)影響離子載體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。

3.2 添加活性酵母和莫能菌素對(duì)活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 本試驗(yàn)采用蒸汽壓片玉米作為活體外發(fā)酵底物，因其淀粉糊化度提高，在瘤胃內(nèi)降解速度快， 易導(dǎo)致有機(jī)酸積累和pH 下降。但根據(jù)本試驗(yàn)發(fā)酵液pH 的范圍看，瘤胃發(fā)酵處于一個(gè)正常pH 的發(fā)酵狀態(tài)。 Miller-Webster 等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，在較高pH 條件下活性酵母對(duì)pH 調(diào)節(jié)的效應(yīng)則不能有效發(fā)揮。本試驗(yàn)中，活性酵母和莫能菌素的添加都未對(duì)體外瘤胃pH 產(chǎn)生顯著影響，可能是因?yàn)榛铙w外發(fā)酵本身處于一個(gè)較高的pH 水平。 活性酵母的添加顯著提高了NH3-N 濃度，可能是因?yàn)榻湍概囵B(yǎng)物能夠提高底物蛋白質(zhì)在瘤胃中的消化，從而導(dǎo)致瘤胃NH3-N濃度的升高。 與之相反，莫能菌素顯著降低了發(fā)酵液中NH3-N 濃度， 可能與莫能菌素對(duì)格蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用會(huì)降低蛋白質(zhì)瘤胃代謝，從而降低瘤胃氨氮濃度有關(guān)。柏研等（2019）在荷斯坦?fàn)倥Ｉ弦驳玫搅讼嗤慕Y(jié)果。

本試驗(yàn)中， 活性酵母對(duì)發(fā)酵液中總VFA 產(chǎn)量、各VFA 的摩爾百分比及乙丙比均未產(chǎn)生顯著影響， 這與其他研究添加酵母產(chǎn)品對(duì)瘤胃發(fā)酵的影響結(jié)果不一致。 Wen 等（2017）報(bào)道，在給采食低質(zhì)粗飼料的泌乳奶牛的日糧中添加活性酵母，能顯著提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸的濃度， 但不影響各類VFA 摩爾比例， 與Andrighetto 等（1993）在給采食高精料日糧的綿羊添加酵母培養(yǎng)物的結(jié)論一致。 Zeleňák 等（1994）在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加活性酵母對(duì)瘤胃VFA 產(chǎn)量及摩爾比例的影響隨發(fā)酵底物的精粗比而改變。 Lynch 和Martin（2002）報(bào)道，當(dāng)以粉碎玉米作為發(fā)酵底物時(shí)，活性酵母對(duì)丙酸及丁酸濃度無(wú)顯著影響， 但能顯著降低乙酸產(chǎn)量，從而降低乙丙比；而當(dāng)以可發(fā)酵淀粉為底物時(shí)，活性酵母對(duì)乙酸影響不大，對(duì)丙酸產(chǎn)量有所提高，但差異不顯著，最終顯著地降低了乙丙比。顯然，酵母類產(chǎn)品對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響規(guī)律并不一致，其會(huì)隨日糧特性的不同而發(fā)生改變。莫能菌素能提高丙酸比例， 降低乙丙比的這一作用已被前人研究一致證實(shí)， 本試驗(yàn)也得到了與之一致的結(jié)果， 而高丙酸型發(fā)酵有利于提高反芻動(dòng)物的能量利用效率。

4 結(jié)論

以蒸汽壓片玉米為發(fā)酵底物時(shí)， 活性酵母的添加能夠減緩谷物的體外發(fā)酵速度， 但對(duì)產(chǎn)氣量及體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)無(wú)顯著影響。 莫能菌素則能顯著提高谷物的體外產(chǎn)氣速度，縮短產(chǎn)氣延滯期，并顯著降低乙酸比例，提高丙酸產(chǎn)量，降低乙：丙比例。