桑 鵬， 王肇衿， 陳貴元， 楊力權(quán)

（1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003；2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

蛋白酶在科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)等方面應(yīng)用廣泛（唐兵等，2000），其主要產(chǎn)自微生物，但在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、多金屬離子等條件下酶的催化活性并不好，常有失活情況發(fā)生（林影等，2000）。 高溫蛋白酶的應(yīng)用前景十分廣闊（廉立慧等，2011），但國(guó)內(nèi)對(duì)高溫蛋白酶產(chǎn)生菌的研究相對(duì)較晚， 對(duì)高溫蛋白酶催化活性方面的研究還鮮有報(bào)道。 本研究以云南大理彌渡縣熱泉土樣為材料， 篩選出產(chǎn)高溫蛋白酶的菌株， 對(duì)其分類鑒定并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究， 旨在為發(fā)酵工業(yè)新備選產(chǎn)蛋白酶菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源， 為進(jìn)一步開發(fā)利用該菌株提供基礎(chǔ)， 也為進(jìn)一步獲得產(chǎn)蛋白酶基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品來(lái)自大理彌渡縣白總旗熱泉的底泥，熱泉水溫55 ℃。

1.1.2 主要儀器 顯微鏡（奧林巴斯）；紫外可見光分光光度計(jì)（上海菁華儀器公司）；高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；水浴恒溫?fù)u床（常州國(guó)華電器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 試劑 酵母抽提物、蛋白胨為英國(guó)進(jìn)口；瓊脂粉為西班牙進(jìn)口分裝；脫脂奶粉、三氯乙酸、folin試劑、濃鹽酸、干酪素、氯化鈉、結(jié)晶紫、碘、乙醇、孔雀綠、番紅等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。DNA 抽提試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒、 膠回收試劑盒和DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自北京天根生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 脫脂奶粉培養(yǎng)基：脫脂奶粉50 g，水500 mL，瓊脂粉10 g，100 ℃滅菌20 min。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，NaCl 10 g， 超純水1000 mL， 調(diào)pH 至7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：豆粕20 g，葡萄糖1 g，蒸餾水200 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株富集 稱取白總旗熱泉底泥2 g 于45 mL 的無(wú)菌蒸餾水中，150 r/min，振蕩15 min。在無(wú)菌條件下， 用移液槍吸取5 mL 懸液于50 mL 的富集培養(yǎng)基中，將接種好的富集培養(yǎng)基置于55 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min 的水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 菌株初篩 將富集好的菌液稀釋至10-3、10-6、10-9倍， 用移液槍分別吸取稀釋的菌液150 μL接種在篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。 于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。 觀察菌落周圍若有水解圈出現(xiàn)，說(shuō)明該菌株能產(chǎn)生蛋白酶。

1.2.3 菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株取少量接種于種子瓶（LB 液體培養(yǎng)基），55 ℃培養(yǎng)24 h 后，將種子液按2%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，55 ℃、150 r/min 水浴搖床培養(yǎng)一周。 離心取上清測(cè)酶活。

酶活測(cè)定：采用福林法（Folin）進(jìn)行酶活測(cè)定（高英等，2004）。 在一定的pH 和溫度下，蛋白酶液和底物酪蛋白反應(yīng)，經(jīng)一定時(shí)間后，加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)， 并使多余的酪蛋白發(fā)生沉淀而與水解產(chǎn)物分開。 過(guò)濾后，取濾液（含蛋白水解產(chǎn)物的三氯乙酸液）用Na2CO3堿化，再加入Folin 試劑使之發(fā)色， 藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的量成正比， 在一定濃度范圍內(nèi)符合朗白-比爾定律，因此，可推測(cè)蛋白酶活性。

酶活力定義：在酶最適反應(yīng)溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸為一個(gè)酶活單位。

酶活力/（μg/mL）= K×OD×N×4/10；

式中：K 為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；N 為酶的稀釋倍數(shù)。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)、 生理生化特征 產(chǎn)酶菌株的形態(tài)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)參照黃秀梨等（2008）的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 16S rRNA 基因序列測(cè)序和分析 根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說(shuō)明書進(jìn)行DNA 的提取。 使用通用引物27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3， 擴(kuò)增細(xì)菌16S rD NA。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s；退火50 ℃，45 s；延伸72 ℃，100 s，最后延伸72 ℃，5 min，循環(huán)30 次，將PCR 產(chǎn)物加入預(yù)先制備好的0.8%的瓊脂糖凝膠中，140V，電泳1 h，瓊脂糖凝膠回收根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說(shuō)明書進(jìn)行PCR 產(chǎn)物回收。 將PCR 回收產(chǎn)物送廣州英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序，將獲得的序列提交GenBank （http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov）， 根據(jù)BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)中細(xì)菌16S rRNA 基因序列進(jìn)行相似性比較分析，利用MEGA 5.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.5 菌株最適生長(zhǎng)溫度 按接種量為1%的菌種于LB 液體培養(yǎng)基中，置于不同的溫度（25、31、37、43、49、55 ℃） 下?lián)u床培養(yǎng)24 h， 然后在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定各個(gè)溫度下菌株生長(zhǎng)的吸光值，以確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)

1.2.6.1 溫度對(duì)酶活的影響 將酶液分別在4 ～75 ℃條件下測(cè)定蛋白酶的活力。

1.2.6.2 pH 對(duì)酶活的影響 在最適酶活溫度下，配制不同pH 的反應(yīng)緩沖液，檢測(cè)不同的pH 對(duì)蛋白酶活力的影響。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性 將1 mL 酶液分別置于不同的溫度（4、37、55、60、75 ℃）下保溫，在保溫15、30、60、90 min 時(shí)測(cè)定酶活。以保溫0 min 溫度下所測(cè)得的酶活為對(duì)照組， 其余溫度下所測(cè)得的酶活與其相比，并計(jì)算相對(duì)酶活，用相對(duì)酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6.4 金屬離子對(duì)酶活的影響 將1 mL 的酶液和10 μL 濃度為0.1 mol/L 的金屬離子（Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+）混勻，將其放置到4 ℃冰箱過(guò)夜，第二天測(cè)定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液反應(yīng)體系作為對(duì)照組， 測(cè)定和觀察金屬離子對(duì)酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選 根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值的大小。篩選到3 株產(chǎn)高溫蛋白酶菌株。其中1 號(hào)菌株水解圈直徑與菌落直徑比值（R1/R2）最大。 經(jīng)復(fù)篩發(fā)現(xiàn)3 株菌均為分泌型蛋白酶產(chǎn)生菌，且1 號(hào)菌株酶活最高，為49.99 U/mL，與初篩的結(jié)果相符。因此，選擇1 號(hào)菌株作為后續(xù)試驗(yàn)研究菌株，命名為Pro-55。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)、 生理生化特征 Pro-55 在LB 培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)72 h 后， 菌落形態(tài)呈圓形，黃色，不透明，黏稠，光滑，表面濕潤(rùn)，中間隆起，邊緣整齊， 菌落整體較小未產(chǎn)菌絲。 革蘭氏染色呈陽(yáng)性，端生芽孢，鞭毛染色后未觀察到鞭毛。

對(duì)Pro-55 的生理生化特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，V-P 試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果均為弱陽(yáng)性。明膠試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。

2.2.2 16S rRNA 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rRNA 基因測(cè)序， 所獲得的序列長(zhǎng)度為1438 bp，將Pro-55 的16S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Pro-55 與短芽孢桿菌屬的16S rRNA 基因序列自然聚類，Pro-55 的16S rRNA 基因序列與16 條相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1， 從圖中可以看出 Pro -55 與 Brevibacillus sp. FJAT -21992（KP728965.1）菌株聚為一群，相似性也最高，表明Pro-55 與Brevibacillus sp.的菌株親緣關(guān)系最近。

根據(jù)Pro-55 的形態(tài)及生理生化特征， 結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第八版）（布坎南，1984），以及Pro-55 16S rRNA 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹，將Pro-55 初步鑒定為短芽孢桿菌屬（Brevibacillus sp.） 的一株菌， 命名為Brevibacillus sp.Pro-55。

圖1 基于16S rRNA 基因序列相似性的菌株P(guān)ro-55 與16 株細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 菌種的最適生長(zhǎng)溫度 按照試驗(yàn)方法，在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定不同溫度培養(yǎng)下LB 培養(yǎng)基的吸光值，以600 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—吸光值關(guān)系曲線，結(jié)果如圖2。

圖2 Pro-55 菌株生長(zhǎng)曲線

從圖2 可知，25 ～43 ℃菌株的生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而增加，43 ℃時(shí)，LB 培養(yǎng)基在600 nm下的吸光值最高，表明43 ℃是菌株的最適生長(zhǎng)溫度。 45 ℃以后，菌株生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而下降，菌株在55 ℃下仍能生長(zhǎng)，表明菌株屬于典型的耐高溫菌。

2.4 菌株P(guān)ro-55 的蛋白酶性質(zhì)

2.4.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)制作對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法， 得出對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.6743x-0.0634， 線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9924，表明線性比較好。

2.4.2 溫度對(duì)酶活的影響 按照試驗(yàn)方法， 在不同溫度下測(cè)定酶的活性，以酶活力為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)作溫度—酶活關(guān)系曲線（圖3）。

圖3 溫度對(duì)Pro-55 蛋白酶活性的影響

從圖3 可以看出，低溫能抑制酶的活性，但不能使酶失活， 在4 ℃的條件下， 蛋白酶仍具有活性，但活性較低，4 ～40 ℃，隨著溫度升高，酶活力增加，在40 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為50 U/mL。在40 ℃之后，隨著溫度升高，蛋白酶活力反而降低，部分酶失去活性。 40 ℃是蛋白酶的最適反應(yīng)溫度，該菌株產(chǎn)生的蛋白酶屬于典型的耐熱蛋白酶。

2.4.3 蛋白酶的最適反應(yīng)pH 從圖4 可以看出，pH 6.0 之前，蛋白酶活力隨著pH 的增加而升高，在pH 6.0 之后， 蛋白酶活力下降速度較快。 pH 6.0 是該蛋白酶的最適反應(yīng)pH，表明菌株P(guān)ro-55產(chǎn)生的蛋白酶屬于酸性蛋白酶。

圖4 pH 對(duì)Pro-55 蛋白酶活性的影響

2.4.4 蛋白酶熱穩(wěn)定性 按照試驗(yàn)方法， 測(cè)定其各個(gè)溫度下不同時(shí)間點(diǎn)蛋白酶的酶活，以保溫0 min測(cè)得的酶活為對(duì)照組， 其余溫度下所測(cè)得的酶活與其相比并計(jì)算相對(duì)酶活， 用相對(duì)酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 Pro-55 蛋白酶的熱穩(wěn)定性

從圖5 可以看出，在37 ℃以下，Pro-55 蛋白酶能夠在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的酶活。在75 ℃保溫60 min，相對(duì)酶活損失近83%。 菌株產(chǎn)生的酶雖然是高溫蛋白酶，但酶在較高的溫度下，酶活性隨著保溫的時(shí)間增加而降低， 酶的熱穩(wěn)定性較差，溫度耐受性質(zhì)符合一般酶的性質(zhì)。

2.4.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響 將加有金屬離子的稀釋酶液在4 ℃中保溫過(guò)夜， 以未加入金屬離子的酶液作為對(duì)照組， 測(cè)定各種金屬離子對(duì)酶活力的影響，結(jié)果見表1。

表1 金屬離子對(duì)Pro-55 蛋白酶活的影響%

從表1 可知，Cu2+對(duì)酶活性有較大促進(jìn)作用，Mg2+、Ca2+有較弱促進(jìn)效果，而Fe2+、K+和Mn2+則有抑制效果，推斷可能不是單一的酶類，有輔酶；說(shuō)明酶液有較強(qiáng)的離子耐受能力。

3 結(jié)論

高溫蛋白酶是一類廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用化工等方面且有著巨大開發(fā)潛力的酶， 在微生物體內(nèi)廣泛存在 （徐輝艷等，2009； 胡青平等，2005）。 本次試驗(yàn)得到的菌株經(jīng)分子鑒定為短芽孢桿菌；其最適生長(zhǎng)溫度為43 ℃，酶反應(yīng)最適溫度40 ℃，酶反應(yīng)最適pH 為6.0，在最適反應(yīng)溫度下酶活力為36.74 μg/mL； 在37 ℃以下酶具有較好的熱穩(wěn)定性。 Ca2+、Zn+、Mg2+、Cu2+等離子對(duì)酶液的酶活性均有促進(jìn)作用， 同時(shí)酶液具有很強(qiáng)的離子耐受力。本文所篩選菌株在55 ℃高溫下依然具有較強(qiáng)的酶活力，且溫度耐受性較強(qiáng)。 綜上所述，此次試驗(yàn)得到的酶在重金屬高溫環(huán)境下的應(yīng)用前景非常廣闊， 且在其他的科研與工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用也有待研究。