曹 丁， 李學(xué)優(yōu)， 肖宏艷， 昝繼清

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

近年來家禽腫瘤和病毒感染引起的雞馬立克病、新城疫、傳染性法氏囊病、傳染性支氣管炎等烈性傳染性疾病呈地方性流行趨勢，每年造成數(shù)十億元的經(jīng)濟損失，是當前養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的大敵，如何有效治療家禽腫瘤和病毒感染性疾病一直是困擾禽病防治的重大難題之一（蔡梅紅等，2007）。 對于獸用抗病毒生物制品來說，與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物和疫苗相比，干擾素（IFN）作為免疫應(yīng)答的自然介導(dǎo)物和調(diào)節(jié)物之一，具有廣譜的抗病毒活性，在臨床上具有良好的應(yīng)用前景（Galligan 等，2006）。尤其是雞a干擾素是一種抗病毒性較強的生物制品，具有作用廣泛、殘留小、幾乎無毒性等特點，為這些疾病的防治提供了新的手段（Platanias 等，2005）。

目前國內(nèi)對于雞a 干擾素的研究多數(shù)處于實驗室階段及小試水平， 對于其下游大規(guī)模高密度發(fā)酵技術(shù)研究缺乏， 其生產(chǎn)還存在著生產(chǎn)成本過高、表達效價低、工藝控制復(fù)雜、生產(chǎn)穩(wěn)定性差、養(yǎng)殖業(yè)對其用量大等問題，難以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)（岳道友等，2010）。

本課題組前期構(gòu)建了含有雞α 干擾素優(yōu)化基因的真核表達載體pPIC9k，并將其5＇端非翻譯區(qū)（5＇UTR）序列進行改造，去除多余的8 個堿基序列，使其與畢赤酵母AOX1（醇氧化酶）的mRNA 序列完全一致， 并初步研究了改造載體在畢赤酵母SMD1168 中的表達和抗病毒活性，在搖瓶水平其抗病毒活性達到1.5×106U/mL。 本研究在此基礎(chǔ)上，在500 L 中試水平，通過研究pH、裝液量、溶氧、誘導(dǎo)條件等因素對畢赤酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)雞α 干擾素的影響，優(yōu)化一套成熟的產(chǎn)雞α 干擾素的畢赤酵母高密度發(fā)酵工藝，為雞α 干擾素的放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌 雞α 干擾素重組畢赤酵母菌SMD1168-pPIC9k-cIFN-α，由廣東省微生物種質(zhì)資源庫保存并提供。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基： 葡萄糖20 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH=7.0，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂粉。 發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油46 g/L，磷酸二氫銨14 g/L，硫酸鉀18 g/L，硫酸鎂15 g/L，硫酸鈣1.5 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L，氫氧 化 鉀1.5 g/L，PTM 鹽4.4 mL/L， 初 始pH 為6.96。

酵母抽提物；胰蛋白胨（英國Oxoid 公司）；瓊脂粉（廣州環(huán)凱生物科技有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱: 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHZ-DA 大容量全溫振蕩器：太倉市實驗設(shè)備廠；5427R 高速冷凍離心機：eppendorf；50、500 L 不銹鋼發(fā)酵罐：上海洋格生物設(shè)備有限公司。

1.4 菌株培養(yǎng)方法 將斜面保存的畢赤酵母菌株接種于種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h， 然后以5%的接種量接種于50 L 發(fā)酵罐中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃，通風量1000 ～2500 L/h，罐壓0.06 MPa，攪拌轉(zhuǎn)速200 ～350 r/min，培養(yǎng)至30 h，OD600達到35 以上后，以10%的接種量過種至500 L 發(fā)酵罐中， 培養(yǎng)溫度為30 ℃，通氣攪拌培養(yǎng)，溶氧控制在30%以上（通過調(diào)節(jié)風量和轉(zhuǎn)速控制），罐壓0.06 MPa，當初始碳源耗盡時，開始流加甘油，當菌體量積累到一定程度時，開始脈沖流加誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達， 發(fā)酵過程分別取樣在線監(jiān)測各種生理指標。

1.5 指標測定

1.5.1 菌體生物量測定 根據(jù)發(fā)酵液活菌數(shù)的對數(shù)值和菌體濕重成一定的線性關(guān)系原理， 通過測其濕重指標來間接反映菌體的生長情況。 測定方法如下：取適量發(fā)酵液，離心洗滌兩次，測定單位體積發(fā)酵液的菌體重量即為菌體濕重（g/L）。

1.5.2 pH 測定 用PHS-25 數(shù)顯酸度計測定。

1.5.3 甘油濃度測定 采用HPLC，島津LC-20A液相色譜儀，氨基柱；流動相：5 mmol/L 硫酸，流速：0.6 mL/min ；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；檢測器：示差折光檢測器；采用外標法定量。

1.5.4 甲醇濃度測定 采用HPLC，島津LC-20A液相色譜儀，氨基柱；流動相：5 mmol/L 硫酸，流速：0.6 mL/min ；柱溫：65 ℃；進樣量：20 μL ；檢測器：示差折光檢測器；采用外標法定量。

1.5.5 雞α 干擾素抗病毒活性的測定 參考蔡梅紅等（2010）的方法，采用細胞病變抑制法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響 在50 L 罐發(fā)酵水平，用氨水和磷酸維持發(fā)酵過程不同的pH，在優(yōu)化培養(yǎng)基中，菌體增殖溫度為30 ℃，誘導(dǎo)溫度為28 ℃，裝液量為60%，通風量1000 ～2500 L/h， 罐壓0.06 MPa， 攪拌200 ～350 r/min，接種量為10%。 培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的碳源逐漸消耗，當碳源消耗完后菌體不再生長，溶氧開始上升，根據(jù)溶氧恒速流加甲醇進行誘導(dǎo)60 h 后放罐，結(jié)果如圖1。

圖1 pH 對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響

圖1 顯示，維持pH 5.5 條件下，發(fā)酵48 h，細胞濕重達到168.6 g/L，產(chǎn)物雞α 干擾素（IFN-α）抗病毒活性達到1×107U/mL。雖在pH 6.0 條件下獲得的細胞濕重與pH 5.5 相比更高，但產(chǎn)物抗病毒活性相對較低，所以選擇維持pH 5.5 進行后續(xù)試驗。

2.2 裝液量對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響 鑒于裝液量對于工程菌發(fā)酵的重要性（影響營養(yǎng)物及氧氣的傳遞性能），考察了50 L發(fā)酵罐中不同裝液量 （80%、70%、60%、50% 和40%）對菌體合成及雞α 干擾素表達的影響，其他條件不變。 結(jié)果表明（圖2），隨著裝液量的增加菌體合成量大致呈下降趨勢。而在裝液量為50% 條件下，獲得較大菌體量，并且產(chǎn)物獲得了最高的抗病毒活性（1.5×107U/mL）。 在40% 裝液量條件下的發(fā)酵液經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)大量細胞碎片的存在， 推測原因可能是在相同攪拌功率條件下， 隨著裝液量的減少，單位體積功率系數(shù)（P/V）將增大，從而對菌體細胞產(chǎn)生較大的剪切力，造成細胞破碎（姜正軍等，2014）。因此選擇裝液量為50%進行后續(xù)試驗。

2.3 溶氧量（DO）對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響 用50 L 發(fā)酵罐進行多批次的溶氧試驗， 通過調(diào)整轉(zhuǎn)速和通風量的大小并通入合適濃度的純氧來控制溶氧DO 值的高低， 使溶氧分別控制在10% ～20%、20% ～30%、30% ～40%、40% ～50%，其他條件不變，根據(jù)溶氧恒速流加甲醇進行誘導(dǎo)60 h 后放罐，測定干擾素活力確定最佳溶氧量，結(jié)果見圖3。

圖2 裝液量對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響

圖3 溶氧量對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響

從圖3 可看出，隨著溶氧量的上升，菌體的生物量和表達蛋白的抗病毒活性都有不同程度的提高，但過高的溶氧量反而會抑制菌體生長和蛋白質(zhì)表達。當發(fā)酵罐D(zhuǎn)O 值控制在30% ～40%時，菌體生物量最高，為185.4 g/L；當發(fā)酵罐D(zhuǎn)O值控制在20% ～30%時，干擾素的抗病毒活性最高，為2×107U/mL，因此選擇誘導(dǎo)表達的DO 值為20% ～30%， 在菌體增殖階段可適當提高溶氧量為30% ～40%。

2.4 誘導(dǎo)前菌體濃度對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響 初始培養(yǎng)基中碳源耗盡后，菌體不再生長，溶氧量開始上升，此時開始流加碳源甘油。 通過控制流加甘油速度和時間不斷提高菌體濃度， 使誘導(dǎo)前菌體濃度分別達到250、300、350、400、450 g/L， 其他條件不變， 根據(jù)溶氧恒速流加甲醇進行誘導(dǎo)60 h 后放罐，通過測定表達上清抗病毒活性確定最佳誘導(dǎo)前菌體濃度，結(jié)果見圖4。

圖4 誘導(dǎo)前菌體濃度對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響

在一定范圍內(nèi)， 畢赤酵母菌體濃度的提高有利于提高蛋白的表達量和活性，圖4 顯示，當誘導(dǎo)前菌體濃度為400 g/L 時， 誘導(dǎo)發(fā)酵60 h 后，干擾素的抗病毒活性最高，達到2.5×107U/mL，過高的誘導(dǎo)前菌體濃度一定程度上抑制了干擾素蛋白的表達， 可能跟溶氧或是營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞不足有關(guān)。 因此，選擇誘導(dǎo)前菌體濃度為400 g/L 為宜。

2.5 誘導(dǎo)劑添加模式對畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素的影響

2.5.1 誘導(dǎo)劑配方的選擇 在初始碳源耗盡后，通過連續(xù)流加甘油使其菌體濃度達到400 g/L，其余發(fā)酵條件不變， 根據(jù)溶氧恒速流加如下不同配方的誘導(dǎo)劑：（1）50%質(zhì)量濃度的甘油：甲醇=1：4；（2）50%質(zhì)量濃度的山梨醇：甲醇=1：4；（3）分析純甲醇。 誘導(dǎo)發(fā)酵60 h 后，測定發(fā)酵上清的抗病毒活性。

從表1 可看出，用甲醇和甘油混合誘導(dǎo)，菌體濃度較高， 分泌干擾素抗病毒效價高于只用甲醇誘導(dǎo)；用甲醇和山梨醇混合誘導(dǎo)，菌體濃度略低于甲醇和甘油混合誘導(dǎo)組， 分泌干擾素抗病毒活性高于甲醇和甘油混合誘導(dǎo)組， 說明山梨醇可以明顯提高畢赤酵母分泌蛋白的活性。 因此選擇甲醇和山梨醇混合作為誘導(dǎo)劑。

表1 不同誘導(dǎo)劑對干擾素活性的影響

2.5.2 誘導(dǎo)劑添加模式的選擇 畢赤酵母工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵時， 誘導(dǎo)劑補料方式基本分為分批式補料、連續(xù)式補料等，據(jù)此確定以下3 種誘導(dǎo)劑添加方案進行誘導(dǎo)表達（張曉龍等，2015）：（1）分批式補料，每次補入0.4%誘導(dǎo)劑，待甲醇消耗完后繼續(xù)補料；（2）分批-連續(xù)式補料，誘導(dǎo)初期加入0.4%誘導(dǎo)劑，甲醇消耗完后， 繼續(xù)補加0.4%誘導(dǎo)劑，5 h 后控制流速為5 ～6 mL/（L·h）；（3）連續(xù)式補料， 誘導(dǎo)初期補料速度為1 mL/（L·h）， 每小時提升一個單位，5 h 后控制流加速度為5 ～6 mL/（L·h）。 誘導(dǎo)過程中每6 h 取樣測定發(fā)酵上清的抗病毒活性，結(jié)果見圖5。

圖5 不同誘導(dǎo)劑添加方式對干擾素活性的影響

從圖5 可看出，采用連續(xù)補料的方式可以使畢赤酵母更好地適應(yīng)甲醇，延長最佳表達周期，干擾素最高抗病毒活性可達到4.0×107U/mL；而采用分批補料的方式， 受甲醇初始濃度過高影響， 畢赤酵母前期未能適應(yīng)碳源變化， 導(dǎo)致36 h 后外源蛋白停止表達，誘導(dǎo)期明顯縮短；采用分批連續(xù)補料的方式，有助于蛋白表達，但前期變換碳源過渡不佳， 導(dǎo)致發(fā)酵后期干擾素效價不高， 因此采用連續(xù)補料的方式進行雞α 干擾素誘導(dǎo)表達。

2.6 50 L 發(fā)酵工藝的確定 通過研究接種量、溫度、初始pH、裝液量、過程pH 控制、溶氧等因素對工程菌發(fā)酵產(chǎn)雞α 干擾素的影響，初步得出最佳發(fā)酵工藝為接種量10%，裝液量50%，菌體增殖階段：控制pH 為6.0，發(fā)酵溫度為30 ℃，溶氧為30% ～40%， 當初始培養(yǎng)基中碳源耗盡后，菌體不再生長，溶氧量開始上升，此時開始流加碳源甘油，使誘導(dǎo)前菌體濃度為400 g/L；誘導(dǎo)表達階段： 控制pH 為5.5， 發(fā)酵溫度為28 ℃， 溶氧為20% ～30%，用50%質(zhì)量濃度的山梨醇：甲醇=1：4的誘導(dǎo)劑，采取連續(xù)補料方式，誘導(dǎo)初期補料速度為1 mL/（L·h）， 每小時提升一個單位，5 h 后控制流加速度為5 ～6 mL/（L·h）， 此過程根據(jù)溶氧控制流速，發(fā)酵60 h 結(jié)束。

在最優(yōu)發(fā)酵工藝下，進行50 L 發(fā)酵罐水平畢赤酵母發(fā)酵表達雞α 干擾素驗證試驗，重復(fù)5 批次，結(jié)果顯示（表2），畢赤酵母在50 L 發(fā)酵水平進行高密度發(fā)酵表達雞α 干擾素，發(fā)酵過程各項參數(shù)重現(xiàn)性較好，表達的蛋白活性穩(wěn)定，具有工業(yè)化生產(chǎn)價值。2.7 500 L 發(fā)酵工藝的確定 在50 L 發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)之上， 對畢赤酵母工程菌株進行了500 L罐發(fā)酵擴大生產(chǎn)， 主要考察發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性和驗證擴大培養(yǎng)后干擾素的抗病毒活性， 試驗重復(fù)5 批。結(jié)果顯示（表3），在最優(yōu)發(fā)酵工藝下，畢赤酵母在500 L 發(fā)酵罐水平，當發(fā)酵24 h，初始碳源耗盡時，菌體濕重為178.9 g/L，此時開始補加甘油，甘油初始流速為3 mL/（L·h）， 每小時提升1.5 單位，5 h 后控制流加速度為10 ～12 mL /（L·h），發(fā)酵時間42 h 時，菌體濕重為412.3 g/L，此時開始補加誘導(dǎo)劑，干擾素效價開始增加，到發(fā)酵96 h時達到最高，為4.5×107U/mL，之后略有下降，菌體濕重有少量增加，之后保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，因此發(fā)酵時間應(yīng)控制在誘導(dǎo)表達60 h 后放罐。 與50 L 罐上的各項發(fā)酵過程參數(shù)相比，500 L 罐發(fā)酵過程各項目標參數(shù)變化趨勢與50 L 較一致，結(jié)果重現(xiàn)性較好，生產(chǎn)過程各項參數(shù)較為穩(wěn)定，且目的蛋白表達量略高于50 L 罐，分泌的雞α 干擾素的抗病毒活性最高為4.8×107U/mL， 可進行穩(wěn)定的工業(yè)化生產(chǎn)。

表2 50 L 發(fā)酵畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素過程穩(wěn)定性

表3 500 L 發(fā)酵畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達雞α 干擾素過程穩(wěn)定性

3 結(jié)論與討論

影響畢赤酵母高密度發(fā)酵表達外源蛋白的因素很多，本研究在前期試驗的基礎(chǔ)上，選取了中試放大過程中幾個關(guān)鍵因素進行優(yōu)化。 畢赤酵母高密度發(fā)酵需要大量的溶氧， 充足的氧氣對誘導(dǎo)階段外源蛋白的表達極為重要（閔兆升等，2014）。有報道認為，如果采用大型發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，外源蛋白的表達水平要比普通搖瓶高出10 ～100 倍（Withers 等，1999）。若溶氧不足，不僅會限制菌體生長， 發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生甲醛和過氧化氫等有毒代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生生物安全問題；若氧氣過量同樣會抑制菌體產(chǎn)生目標蛋白。 本研究采用按一定比例通入純氧和空氣的方式來保證足夠的溶氧，控制DO 值在合適的水平。

另外， 誘導(dǎo)前菌體濃度對異源蛋白的表達也有影響。畢赤酵母中蛋白質(zhì)表達分為兩個階段，首先是在含有甘油的培養(yǎng)基中生長菌體， 達到一定的菌體濃度，理論上是菌體越多，培養(yǎng)基中氧和營養(yǎng)供給越受限制。 事實上高密度不一定有利于外源蛋白的產(chǎn)生，這跟表達的外源蛋白的性質(zhì)，如溶解性、穩(wěn)定性、毒性等以及發(fā)酵罐能提供的最大供氧量相關(guān)（Besse 等，1997）。本試驗發(fā)現(xiàn)，在菌體濕重低于400 g/L 時，外源蛋白較難降解，能有較高水平的表達量。

以甲醇作為誘導(dǎo)劑不但可以誘導(dǎo)AOX 啟動子驅(qū)動外源蛋白的表達， 也可以作為碳源維持表達過程的能量消耗。研究表明，甲醇還可以與山梨醇和甘油混合補料誘導(dǎo)表達， 一方面可增加碳源和能量供給，利于菌株生長和蛋白質(zhì)表達；另一方面可降低產(chǎn)熱和耗氧速率， 從而提高蛋白質(zhì)表達（林俊涵，2009）。但甘油對AOX1 啟動子有阻遏作用，采用山梨醇和甲醇作為誘導(dǎo)劑，可減弱這種抑制作用， 還能夠減緩目的蛋白的胞外降解及降低毒副產(chǎn)物的積累， 同時產(chǎn)熱值更低 （Calik 等，2009）。 研究表明，山梨醇和甲醇混合流加的策略不但可以增加細胞密度、縮短誘導(dǎo)時間，還能夠提高外源蛋白的表達量（武婕等，2016），這也與本研究的結(jié)果一致。

本研究通過觀察pH、裝液量、溶氧、誘導(dǎo)條件等因素對工程菌發(fā)酵產(chǎn)雞α 干擾素的影響，得出一套畢赤酵母高密度中試擴大發(fā)酵工藝，用此工藝條件可實現(xiàn)500 L 規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)雞α干擾素，并且工藝穩(wěn)定，雞α 干擾素的抗病毒活性可達到4.5×107U/mL 以上， 優(yōu)化發(fā)酵工藝跟初始發(fā)酵工藝相比，生產(chǎn)成本降低55%，發(fā)酵效價提高了3.5 倍， 并且培養(yǎng)基組分成本較低，適合規(guī)?；a(chǎn)。 本研究將改變雞α 干擾素難以規(guī)?；a(chǎn)的現(xiàn)狀，大幅度降低生產(chǎn)成本，在同類產(chǎn)品中的市場競爭力將大大提高， 同時可以解決禽畜疫病防治過程中的抗生素濫用和疫苗滴度低的問題， 提高我國禽類養(yǎng)殖業(yè)的健康水平。