劉 娟 胡敏霞 任 偉 馬 騰 朱 強(qiáng) 趙漢學(xué)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院超聲診斷科，北京 100730)

光聲成像是一種新型成像技術(shù)，它將光學(xué)成像和超聲成像的優(yōu)點有機(jī)結(jié)合，使得此種成像模式既具有較高的空間分辨率，又具有探查深部組織的能力[1]。還可通過發(fā)展光聲納米探針，在活體組織層面對疾病的病理過程實現(xiàn)分子水平定性、定量研究，從而為目標(biāo)疾病的早期診斷提供技術(shù)支撐[2-3]。光聲成像需借助內(nèi)源性分子(血紅蛋白、黑色素)或外源性(有機(jī)染料、熒光蛋白、無機(jī)納米粒、碳納米管、卟啉等)生色團(tuán)實現(xiàn)其成像。有機(jī)染料、熒光蛋白、金屬納米粒子存在耐光性不佳等缺點[4]，而卟啉類則有光毒性缺點[5]。半導(dǎo)體聚合物納米粒因其優(yōu)異的光學(xué)特性，兼有較好的生物相容性，是一種較為理想的光聲成像材料[6]。因此，本研究欲制備一種半導(dǎo)體聚合物納米粒，對其表征及安全性進(jìn)行評價，并初步評價其光聲成像效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗材料

二棕櫚酸磷脂酰膽堿(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC)購自美國Sigma-Aldrich公司；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000{1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000], DSPE-PEG2000}, 購自美國Avanti Lipids公司；2,6-[4,4-雙-(2-乙基己基)-4H-環(huán)戊(2,1-b;3,4-b’)雙噻吩]-交替-4,7-(2,1,3-苯并噻二唑) [poly(cyclopentadithiophene-alt-benzothiadiazole),PCPDTBT]購自美國Sigma-Aldrich公司；4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)購自美國Sigma-Aldrich公司；BALB/c雌性裸鼠，體質(zhì)量為18～22 g，購自天津醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；人宮頸癌HeLa細(xì)胞、小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；Celltiter 96?Aqueous 單溶液細(xì)胞增生檢測試劑盒購自美國Promega公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。

1.1.2 實驗儀器

W-150聲振儀購自美國Branson公司；LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)購自德國CarlZeiss公司；高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；Nano-ZS90粒度分析儀購自英國Malven公司；IVIS活體成像儀購自美國CRI公司；酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司；光聲成像儀2100高分辨率成像系統(tǒng)購自加拿大Visualsonics公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米粒子制備

①將0.3 mg的PCPDTBT聚合物溶解在1 mL的四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)中，將此溶液快速加入9 mL的去離子水中，使用輸出功率為6 W的聲振儀連續(xù)振動30 s。②將1 mg的DPPC、20 mg的DSPE-PEG2000加入4 mL THF和去離子水的溶液中(1.6 mL THF和2.4 mL去離子水)。③將步驟①制備的溶液與步驟②制備的溶液快速混合，聲振儀振動1 min，溶液中THF置于45 ℃氮氣環(huán)境下蒸發(fā)，使用0.22 μm過濾膜過濾，PBS洗3次，4 000 r/min冷凍離心機(jī)離心，最終制備濃度為0.1 mg/mL的SPNs混懸液，置于4 ℃貯存間保存待用。

1.2.2 SPNs的表征

室溫下取適量的SPNs混懸液，用去離子水將其質(zhì)量濃度稀釋至10 μg/mL，使用粒徑分析儀分析樣品的平均粒徑及其分布。使用透射電鏡觀察其形貌。將SPNs重懸于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中，在4 ℃條件下攪拌孵育，分別于第1、2、3、4、5、6 d取樣測量SPNs粒徑大小，觀察其穩(wěn)定性。

1.2.3 體外細(xì)胞毒性實驗

接種HeLa細(xì)胞在含有DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中，依次加入質(zhì)量濃度為5、10、20、30 μg/mL SPNs混懸液孵育24 h，隨后加入20 μL的MTS，再孵育3 h，吸出培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜溶解已形成的沉淀，利用酶標(biāo)儀測定各孔在550nm處的吸光度，并計算細(xì)胞相對活力。

1.2.4 體外細(xì)胞吞噬實驗

將Hela細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待腫瘤細(xì)胞生長良好時，加入適量的SPNs繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的多聚甲醛固定15 min，隨后用PBS洗滌細(xì)胞3次，用10 μg/mL的DAPI染色10 min，使用CLSM觀察HeLa細(xì)胞吞噬SNPs情況。

1.2.5 體外IVIS近紅外熒光成像

將所制備的SPNs配制成2.5、5、10、20、30、60 μg/mL濃度梯度的混懸液，各取100 μL置于96孔板中，以PBS作為對照組，將其置于小動物活體成像儀IVIS中，使用激發(fā)波長680 nm、發(fā)射波長840 nm成像，獲得光譜圖。

1.2.6 荷瘤裸鼠光聲成像

6只4T1荷瘤裸鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組，成像前使用2%(體積分?jǐn)?shù))的異氟醚麻醉，一組(n=3)經(jīng)尾靜脈注入120 μL的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液[7]，另一組(n=3)注入120 μL含30 μg SPNs混懸液，裸鼠被置于光聲成像平臺，腫瘤處涂布耦合劑，超聲探頭置于腫瘤表面，啟動掃描裝置，用680 nm激光輻照，獲取裸鼠4T1腫瘤光聲圖和數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SPNs的表征及穩(wěn)定性觀察

所制備的SPNs為淺藍(lán)色混懸液，透射電鏡下SPNs呈球形(圖1)，大小均一、分散性好。粒度分析儀測得其平均粒徑為(61±3)nm，平均電位為(-38±2)mV。通過6 d時間的觀察，SNPs粒徑大小沒有顯著變化，說明所制備的SPNs性能穩(wěn)定(圖2)。

圖1 SPNs的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscope image of SPNs

圖2 在PBS中SPNs的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of SPNs in PBS over 6 days

2.2 體外細(xì)胞毒性實驗

5、10、20、30 μg/mL 的SPNs混懸液與HeLa細(xì)胞孵育24 h后，各濃度下HeLa細(xì)胞的相對活力與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明細(xì)胞相對活力沒有受到明顯影響(表1，圖3)。

表1 不同濃度的SPNs孵育HeLa細(xì)胞體外觀察細(xì)胞活性Tab.1 In vitro viability of HeLa cell treated with SPNs solutions at different concentrations

圖3 不同濃度的SPNs與HeLa細(xì)胞共同孵育24 h，MTS測定細(xì)胞活力Fig.3 MTS evaluation of HeLa cell viability after cells were incubated with SPNs at different concentrations for 24 hours

2.3 體外細(xì)胞吞噬實驗

SPNs混懸液與HeLa細(xì)胞共同孵育24 h，用DAPI染色細(xì)胞核，熒光掃描共聚焦顯微鏡顯示SPNs主要分布于HeLa細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖4)。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡顯示HeLa細(xì)胞吞噬SPNsFig.4 Internalization of SPNs by HeLa cell on confocal laser scanning microscopy

2.4 體外近紅外熒光成像

SPNs混懸液(pH=7.4)，在激發(fā)波長680 nm、發(fā)射波長840 nm成像，獲得SPNs近紅外熒光圖像(圖5)，與0.9%(質(zhì)量濃度)氯化鈉注射液對照組對比，隨著SPNs混懸液質(zhì)量濃度的升高，近紅外熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。

圖5 不同濃度的SPNs近紅外熒光圖Fig.5 Intensity of near infrared imaging at different SPNs concentrations

2.5 荷瘤裸鼠的光聲成像

SPNs組在680 nm激光輻照下，4T1腫瘤顯示增強(qiáng)的光聲信號(表2)，而對照組[0.9%(質(zhì)量濃度)氯化鈉注射液]僅顯示微弱增強(qiáng)的光聲信號詳見圖6，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖6 實驗組與對照組裸鼠移植瘤4T1光聲信號強(qiáng)度比較Fig.6 Comparison of photoacoustic signals in 4T1 murine tumor between experimental group and control group

3 討論

與有機(jī)染料、熒光蛋白、金屬納米粒子存在耐光性不佳，卟啉具有光毒性缺點，半導(dǎo)體聚合物因其優(yōu)異的光學(xué)、電子學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于光電器件制造、生物傳感、組織工程等領(lǐng)域。使用半導(dǎo)體聚合物制備的納米粒子具有高光吸收性、高光穩(wěn)定性等特點，而且還具備光學(xué)性質(zhì)可調(diào)節(jié)、尺寸可控、無重金屬的毒性、生物相容性好等優(yōu)點[8]，近年受到國內(nèi)外一些研究者的關(guān)注，并在光聲成像方面進(jìn)行了相關(guān)研究。

本研究依照納米沉淀技術(shù)制備的SPNs具有粒徑較小(61±3)nm、分布均一、分散性好等特征。既往研究[9]顯示腫瘤微血管孔徑約為100～780 nm，而正常組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接空隙小于2 nm，這可能意味著本研究所制備的較小粒徑的納米粒更易于通過增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention, EPR)，穿過腫瘤微血管孔隙到達(dá)4T1腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在腫瘤區(qū)富集，從而發(fā)揮腫瘤顯像的作用。

本研究所制備的SPNs具有穩(wěn)定、細(xì)胞毒性低，對細(xì)胞生存率影響較小等特征，適合經(jīng)鼠尾靜脈途徑注入。體外近紅外熒光成像顯示，在激發(fā)波長680 nm、發(fā)射波長為840 nm處成像，隨著SPNs質(zhì)量濃度的提高，熒光信號明顯增強(qiáng)，這與SPNs具有較強(qiáng)的吸光性特性有關(guān)。

本文中，使用所制備的SPNs評價荷瘤裸鼠光聲成像效果，結(jié)果顯示腫瘤內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的光聲信號[(3.13±0.26)auvs(0.21±0.04)au,P<0.05]，既往少量文獻(xiàn)[10]也佐證本文之所見。較強(qiáng)的光聲信號獲得可能與SPNs在近紅外Ⅰ區(qū)強(qiáng)吸光性有關(guān)，在激光輻照下，光熱轉(zhuǎn)化效能提高，組織受熱膨脹，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的光聲信號。

由于本文僅是SPNs在光聲成像中的初步探討，所制備的SPNs也未連接特異性配體，未能實現(xiàn)腫瘤的主動靶向成像，未來的研究中將賦予SPNs特異性配體以實現(xiàn)其靶向性成像以及藥物遞送等多種功能。

綜上所述，本試驗所制備的SPNs粒徑較小、安全、穩(wěn)定，在鼠腫瘤模型使用獲得較強(qiáng)的光聲信號，具備一定的臨床轉(zhuǎn)化潛能。