張?zhí)N顯 王雅梅 周 萍*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京 100069)

女性乳腺由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成。乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮組織中的惡性腫瘤。目前，乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。據(jù)估計(jì)，2017年美國有255 180例新發(fā)病例和41 070例乳腺癌死亡病例[1]。乳腺癌常見的3種亞型是雌激素受體陽性(estrogen receptor positive,ER+)、人類表皮生長因子受體2陽性(HER2+)和三陰型。相關(guān)研究[2-5]表明肥胖、雌激素和孕激素的使用、高齡初產(chǎn)、酗酒等因素能夠增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。除了以上幾種因素外，基因突變、表觀遺傳機(jī)制在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中也起到重要作用。過去幾年中，很多研究[6-8]表明非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)參與到致癌過程中，例如微小RNA(micro RNA，miRNA)，長非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等[6]，可以作為乳腺癌識(shí)別、預(yù)后的生物標(biāo)志物[7]。作為新的內(nèi)源性的ncRNA，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)控作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一[8]。

circRNA是一種新的內(nèi)源性ncRNA，其長度為幾百到幾千個(gè)核苷酸[9]。與線性RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同的是，circRNA通過RNA的3′端和5′端的共價(jià)鍵形成，具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[10-11]，但circRNA的生物發(fā)生過程尚不清楚。盡管如此，越來越多的研究[6]證明circRNA參與到了一系列的病理發(fā)生過程中。circRNA參與疾病發(fā)生過程的機(jī)制有以下幾種途徑：①circRNA作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)和“海綿吸附miRNA”(miRNA sponges)參與致癌的調(diào)節(jié)過程。miRNA通過與mRNA的3′端結(jié)合負(fù)向調(diào)節(jié)mRNA，有關(guān)研究[12]顯示，其他具有miRNA靶點(diǎn)的RNA也同樣可以與mRNA競爭miRNA。研究[13]顯示含有miRNA的反應(yīng)元件(miRNA reponse element，MER)的circRNA可以與miRNA相互作用并充當(dāng)“海綿吸附miRNA”，以此削弱miRNA對(duì)靶基因的抑制作用。②circRNA可以特異性結(jié)合蛋白質(zhì)，直接或通過RNA間接阻斷蛋白質(zhì)的功能[14-15]。③調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，雖然大部分circRNA作為ceRNA和“海綿吸附miRNA”調(diào)節(jié)miRNA，但相關(guān)研究[16]表明，一些circRNA可以順式或反式的調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。④普遍認(rèn)為circRNA是一種特殊的內(nèi)源性的ncRNA，不能直接翻譯為蛋白質(zhì)。但最近的研究[17-18]顯示，一些動(dòng)物體內(nèi)circRNA(如小鼠、果蠅)可以直接翻譯蛋白質(zhì)并調(diào)控其生理過程。circRNA在乳腺癌患者體內(nèi)存在差異表達(dá)，可能是乳腺癌細(xì)胞增生的生物標(biāo)志物且與乳腺癌亞型相關(guān)[19-20]。

轉(zhuǎn)座酶可接近性染色質(zhì)測序技術(shù)(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq)，可以只利用少量細(xì)胞快速得到調(diào)控的多維信息。ATAC-seq可以同時(shí)獲得“開放”染色質(zhì)的位置、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)、核小體的調(diào)控區(qū)域和染色質(zhì)狀態(tài)等信息，在表觀遺傳機(jī)制研究領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[21-22]。脫氧核苷酸酶Ⅰ超敏感位點(diǎn)測序技術(shù)(DNase Ⅰ hypersensitive sites sequencing，DNase-seq)是利用脫氧核苷酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ) 超敏感位點(diǎn)捕獲技術(shù)，通過DNase Ⅰ對(duì)裸露在蛋白質(zhì)包裹之外的DNA進(jìn)行酶切，捕獲基因活化區(qū)域DNA片段，然后進(jìn)行高通量測序[23]。

本文利用ATAC-seq和DNase-seq數(shù)據(jù)，全基因范圍分析乳腺癌MCF-7、T-47D和MDA-MB-231細(xì)胞系中circRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而構(gòu)建了乳腺癌中活化circRNA基因的功能互作網(wǎng)絡(luò)，從而挖掘出乳腺癌中的主要功能組circRNA和關(guān)鍵活化circRNA基因。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)

本研究使用到乳腺癌的MCF-7、T-47D、MDA-MB-231細(xì)胞系的ATAC-seq和DNase-seq測序數(shù)據(jù)和人類circRNA數(shù)據(jù)庫。①M(fèi)CF-7、MDA-MB-231細(xì)胞系的ATAC-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下載于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus, GEO)(網(wǎng)址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE97583)的GSE97583[24]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。②MCF-7、T-47D細(xì)胞系的DNase-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下載于UCSC基因?yàn)g覽器中Table Browser的Duke DNase-seq HS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(網(wǎng)址：https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables)，和GEO數(shù)據(jù)庫的GSE108167(網(wǎng)址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE108167)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。③circRNA的高通測序數(shù)據(jù)下載于circBase中所有已發(fā)現(xiàn)的人類circRNA[25-27]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(網(wǎng)址：http://www.circbase.org/)。

1.2 軟件

本文所用軟件有：Windows 10，Access 2010數(shù)據(jù)庫，Cytoscape 3.6.1(網(wǎng)址：https://cytoscape.org/)版本的圖形顯示軟件[28]，Cytoscape3.6.1插件ClueGo V2.5.2[29]，KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址：https://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)。

1.3 方法

本文工作主要環(huán)節(jié)為特異circRNA篩選、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和功能分析，方法流程圖如圖1所示。

圖1 分析方法流程圖Fig.1 The flow chart of analyzing method

1.3.1 于Access數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘

首先利用Access 2010構(gòu)建“乳腺癌開放染色質(zhì)高通測序數(shù)據(jù)庫”，該數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)表由6個(gè)高通測序樣本、人類基因hg19(網(wǎng)址：http://genome.ucsc.edu/)和circRNA(網(wǎng)址：http://www.circbase.org/)構(gòu)成，基因版本配準(zhǔn)采用在線轉(zhuǎn)換工具：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver。然后利用SQL語句對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選挖掘。數(shù)據(jù)篩選實(shí)例詳見圖2(T-47D的DNase-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)和circRNA數(shù)據(jù)為例)。

圖2 數(shù)據(jù)篩選實(shí)例Fig.2 Examples of data mining

以此初步篩選出與乳腺癌相關(guān)的circRNA，以備進(jìn)一步分析。

1.3.2 活化circRNA基因KEGG pathway富集篩選

將篩選出的活化circRNA對(duì)應(yīng)的基因放入KEGG數(shù)據(jù)庫中，利用KEGG Mapper對(duì)這些特異基因進(jìn)行功能分析，并進(jìn)一步篩選出與腫瘤(特別是與乳腺癌)相關(guān)通路的活化circRNA基因。在此結(jié)果中最終篩選出3個(gè)細(xì)胞系共有活化circRNA對(duì)應(yīng)的基因，依據(jù)Gene Ontology(GO)的分子生物過程構(gòu)建乳腺癌活化circRNA基因互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3.3 基于GO生物過程的乳腺癌活化circRNA基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在Cytoscape 3.6.1平臺(tái)中，使用ClueGo 2.5.2將經(jīng)過數(shù)據(jù)挖掘篩選出的活化circRNA基因的集合和KEGG pathway富集篩選出的3個(gè)細(xì)胞系共有的活化circRNA基因的集合依據(jù)GO 生物過程構(gòu)建乳腺癌活化circRNA基因互作網(wǎng)絡(luò)，GO版本為Biological Process-EBI-UniProt-GOA(日期：2018-04-09)，網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法及參數(shù)選擇：依據(jù)GO 術(shù)語進(jìn)行分組，網(wǎng)絡(luò)特異性為中等，P<0.05，為了細(xì)化模組功能，GO 術(shù)語層級(jí)設(shè)置為10～20級(jí)，模組最少基因數(shù)為3，占所在功能或通路基因的百分比為4%以上，網(wǎng)絡(luò)連接度的Kappa 評(píng)分為0.5，富集分析為雙尾超幾何分布檢驗(yàn)，P值校正方法為“Bonferroni step down”。

2 結(jié)果

2.1 MCF-7高敏感位點(diǎn)circRNA構(gòu)成比

本文分析MCF-7細(xì)胞捕獲高敏感位點(diǎn)circRNA為7 458個(gè)，含有utr區(qū)的基因是10 163個(gè)，捕獲不含3utr和5utr的基因的circRNA是3 501個(gè)。由此可見在乳腺癌中circRNA的表達(dá)調(diào)控是非?；钴S的。根據(jù)circRNA綜合數(shù)據(jù)庫CIRCpedia v2(網(wǎng)址：http://www.picb.ac.cn/rnomics/circpedia/)的研究，線性RNA中也包含一定比例的circRNA[30]。為此本研究以DNase-seq和ATAC-seq所有捕獲的circRNA為研究對(duì)象，即不考慮該基因是否包含utr區(qū)。

2.2 3種乳腺癌亞型對(duì)比

T-47D捕獲circRNA最高，其次是MCF-7，最少的是MDA-MB-231。就兩種實(shí)驗(yàn)而言，DNase-seq捕獲率遠(yuǎn)高于ATAC-seq。將3種細(xì)胞捕獲的活化circRNA基因分別構(gòu)建了互作網(wǎng)絡(luò)，從結(jié)果看它們拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相似，只是每個(gè)功能模組基因構(gòu)成比例略有差異。

綜上所述，萊考夫非常強(qiáng)調(diào)概念隱喻在數(shù)學(xué)認(rèn)知中的作用，認(rèn)為概念隱喻是理解復(fù)雜數(shù)學(xué)思想的核心認(rèn)知機(jī)制。概念隱喻是算術(shù)所需要的一種重要的認(rèn)知能力。人們正是通過隱喻對(duì)數(shù)學(xué)中的概念進(jìn)行認(rèn)知和理解，概念隱喻使人們超越了極少的先天算術(shù)和簡單的數(shù)數(shù)能力，延伸了人們的認(rèn)知能力，獲得了進(jìn)一步的算術(shù)能力。物體集合隱喻、對(duì)象建構(gòu)隱喻、量尺隱喻和沿路線運(yùn)動(dòng)隱喻是四種基本的基礎(chǔ)隱喻，也是人們擴(kuò)展算術(shù)的重要的隱喻能力。這四種基本的基礎(chǔ)隱喻都是以隱喻描述了人們的日常經(jīng)驗(yàn)與數(shù)字之間的映射關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，3種細(xì)胞捕獲的活化circRNA基因主要富集在細(xì)胞代謝的生物過程中，其中DNase-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的MCF-7和T-47D細(xì)胞的活化circRNA基因富集在有機(jī)氮化合物代謝過程(分別占11.58%、10.67%)；ATAC-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的活化circRNA基因分別主要富集在細(xì)胞大分子代謝過程(15.43%)和細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程(18.35%)。

除了細(xì)胞代謝的生物過程，本研究捕獲的活化circRNA基因也顯著富集在其他與腫瘤相關(guān)的生物過程中，包括：DNase-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的MCF-7細(xì)胞的活化circRNA基因顯著富集在細(xì)胞正調(diào)節(jié)(7.61%)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)(3.65%)、細(xì)胞組分生物合成調(diào)控(3.57%)、生物過程負(fù)調(diào)控(3.01%)、細(xì)胞有絲分裂周期(2.3%)；DNase-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的T-47D細(xì)胞的活化circRNA基因顯著富集在細(xì)胞正調(diào)節(jié)(7.26%)、超分子纖維組織(3.48%)、細(xì)胞蛋白質(zhì)定位(3.63%)、生物過程負(fù)調(diào)控(2.74%)、細(xì)胞有絲分裂周期(2.3%)；ATAC-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的MDA-MB-231細(xì)胞的活化circRNA基因顯著富集在細(xì)胞組分組織正調(diào)節(jié)(10.8%)、細(xì)胞分解代謝過程(8.49%)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)(4.94%)、細(xì)胞骨架組織(4.01%)、蛋白質(zhì)定位(3.24%)、細(xì)胞有絲分裂周期(3.09%)；ATAC-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的MCF-7細(xì)胞活化circRNA基因顯著富集在細(xì)胞過程正調(diào)節(jié)(9.8%)、細(xì)胞器蛋白質(zhì)定位(9.24%)、細(xì)胞蛋白質(zhì)定位(5.6%)、細(xì)胞組分裝配(4.06%)、蛋白質(zhì)定位(2.94%)、有絲分裂細(xì)胞周期過程(2.8%)。為此本研究用3種細(xì)胞系共有的circRNA進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 KEGG功能分析

對(duì)3種細(xì)胞捕獲的活化circRNA基因進(jìn)行KEGG功能分析，由結(jié)果可見比對(duì)到的關(guān)鍵信號(hào)通路皆與腫瘤有關(guān)。本研究中選取了對(duì)腫瘤起關(guān)鍵作用的18個(gè)信號(hào)通路(表1)。根據(jù)這18個(gè)信號(hào)通路最終篩選出了326個(gè)共有活化circRNA基因，并據(jù)此進(jìn)行共有基因的表達(dá)調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及GO分子功能富集分析。

表1 活化circRNA基因所屬關(guān)鍵信號(hào)通路Tab.1 Key signaling pathways for activated circRNA gene

2.4 互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分子功能分析

為了全面探索3個(gè)細(xì)胞系共有活化circRNA基因的生物學(xué)功能，本研究進(jìn)行分子功能富集分析及生物過程的表達(dá)調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。分子功能富集分析結(jié)果如圖3所示，由結(jié)果可見,這些活化circRNA基因顯著富集在結(jié)合蛋白質(zhì)和刺激活化功能區(qū)。

圖3 活化circRNA基因分子功能Fig.3 Molecular function of activated circRNA gene

利用Cytoscape 3.6.1的ClueGo插件構(gòu)建的生物過程表達(dá)調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如圖4所示。

圖4 活化circRNA基因功能互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Functional interaction network of activated circRNA genes

根據(jù)構(gòu)建的生物過程表達(dá)調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)，其功能模組主要分布于細(xì)胞代謝、重要信號(hào)通路、生物過程的調(diào)控、生物過程反應(yīng)等生物過程中，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)主要的功能模組最終本研究識(shí)別出了PTK2B、PDCD6IP、ABL1、EGFR、RHOA、MTOR、NRP1、ATR、CTNNB1、ILK、NF1、PRKCA、HNRNPK、MEF2C、PMAIP1、LYN、NR4A3、SRF、AREG、PML、PTK2、ROCK2、TGFBR2、VEGFA、DLG1、HRAS、ITGA2、CREB1、STAT3、RUNX2、TIAM1等31個(gè)hub基因。這些基因所對(duì)應(yīng)的捕獲到的活化circRNA如圖6所示。

圖5 活化circRNA基因重要功能組Fig.5 Important functional groups of activated circRNA genescircRNA:circular RNA.

圖6 hub基因的活化circRNA列表Fig.6 Activated circRNA list of hub genescircRNA:circular RNA.

從圖6中看出，PTK2基因?qū)?yīng)的活化circRNA最多，PTK2在ErbB信號(hào)通路中，對(duì)細(xì)胞粘連遷移起直接作用，由于PTK2活化circRNA多，因此circRNA吸附的miRNA的數(shù)量和種類也會(huì)隨之增多，從而降低了miRNA對(duì)PTK2基因的mRNA調(diào)控。其次是MOTR基因?qū)?yīng)的活化circRNA，MOTR基因在乳腺癌通路中直接對(duì)細(xì)胞的增生和存活起作用。由此可見上述circRNA在乳腺癌中起重要作用。

由于circRNA可以直接影響其對(duì)應(yīng)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平， circRNA活化程度越高其對(duì)應(yīng)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平也會(huì)增高，圖5中顯示了依據(jù)活化circRNA構(gòu)建的基因互作網(wǎng)絡(luò)功能組，更顯示出了circRNA在乳腺癌中的作用。

3 討論

隨著circRNA領(lǐng)域的發(fā)展，已經(jīng)建立了許多關(guān)于circRNA的數(shù)據(jù)庫以促進(jìn)circRNA的分析。circBase，CIRC pedia v2和Deepbase 2.0數(shù)據(jù)庫包含許多關(guān)于不同物種的circRNA，并提供詳細(xì)信息。CSCD和CircInteractome數(shù)據(jù)庫可用作預(yù)測miRNA反應(yīng)元件和RNA結(jié)合蛋白質(zhì)的工具。CirclncRNAnet數(shù)據(jù)庫提供了一種分析測序結(jié)果的簡便方法。 ExoRBase數(shù)據(jù)庫提供了人類血液外泌體中存在的58 330個(gè)circRNA。 circRNA Disease數(shù)據(jù)庫記錄了多種疾病中經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的circRNA[31]。Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫是一個(gè)提供miRNA-ncRNA互作網(wǎng)絡(luò)和生物信息學(xué)應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫的開發(fā)者利用108個(gè)CLIP-seq(PAR-CLIP，HITS-CLIP，iCLIP，CLASH)數(shù)據(jù)集鑒定出了9 000多個(gè)miRNA-circRNA互作關(guān)系[32]。最近有研究人員[33]使用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫鑒定CLIP-seq數(shù)據(jù)中miRNA-circRNA的互作關(guān)系，并開發(fā)了circSeeker，circAnno和clipSearch生物信息學(xué)分析軟件用于注釋和識(shí)別circRNA及其與miRNA的相互作用。目前對(duì)circRNA生物信息學(xué)分析大多基于表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選在腫瘤細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的circRNA，并利用上述公開數(shù)據(jù)庫和軟件分析預(yù)測circRNA-miRNA的互作網(wǎng)絡(luò)，例如有研究人員[34]利用表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選出了肝癌細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNA，并利用CSCD和CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測差異表達(dá)的circRNA的潛在靶miRNA，構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，揭示circRNA對(duì)肝癌的調(diào)控作用。本研究立足于circRNA的表達(dá)調(diào)控，借助Access數(shù)據(jù)庫使用SQL語句對(duì)MCF-7、T-47D、MDA-MB-231細(xì)胞系的ATAC-seq和DNase-seq實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析挖掘，鑒定出在乳腺癌細(xì)胞中可能出現(xiàn)circRNA的活化染色質(zhì)位點(diǎn)，篩選出3種乳腺癌共有的活化circRNA基因，并從功能角度構(gòu)建活化circRNA互作網(wǎng)絡(luò)。由于目前對(duì)circRNA的注釋信息尚不完善，而對(duì)基因的注釋比較完整，因此筆者利用ClueGo插件對(duì)活化circRNA基因進(jìn)行生物學(xué)分析，并構(gòu)建活化circRNA基因的生物過程調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)，以此預(yù)測篩選出的活化circRNA對(duì)乳腺癌的調(diào)控作用。

目前相關(guān)研究[35]表明，癌細(xì)胞的一個(gè)新興特點(diǎn)是改變代謝。腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴細(xì)胞代謝重編程，細(xì)胞代謝重編程也是致癌性病變的直接或間接結(jié)果[36]。本研究的結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞染色質(zhì)中處于活化狀態(tài)的circRNA對(duì)應(yīng)的基因，其參與的生物過程主要是細(xì)胞代謝，正、負(fù)調(diào)控，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡、增生、分化，重要信號(hào)通路，細(xì)胞反應(yīng)等重要的細(xì)胞生物過程，因此表明circRNA在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。尤其是發(fā)現(xiàn)的hub基因的circRNA起到至關(guān)重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)盡管一個(gè)基因編碼區(qū)可能包含多個(gè)circRNA，但并非捕獲到基因編碼區(qū)上全部circRNA。例如PTK2B基因在其編碼區(qū)內(nèi)有8個(gè)circRNA：hsa_circ_0083760、hsa_circ_0083759、hsa_circ_0083765、hsa_circ_0083764、hsa_circ_0083761、hsa_circ_0083762、hsa_circ_0083758和hsa_circ_0083763，但在本研究中僅捕獲到hsa_circ_0083759和hsa_circ_0083762，根據(jù)miRTarBase(miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫)數(shù)據(jù)庫hsa_circ_0083759和hsa_circ_0083762可能作為hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-517c-3p和hsa-miR-517a-3p的競爭性內(nèi)源RNA和“海綿吸附miRNA”，這說明在乳腺癌中circRNA的啟動(dòng)是有針對(duì)性的，很可能是針對(duì)某些特定的miRNA作為競爭性內(nèi)源RNA和“海綿吸附miRNA”。

在本研究中連接度最高的circRNA對(duì)應(yīng)的基因是PTK2B，該基因編碼細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶。最新研究[37]表明，PYK2B水平可以預(yù)測結(jié)腸腺癌手術(shù)切除后的預(yù)后。各種治療模型中circRNA的表達(dá)譜尚未得到廣泛研究，但已經(jīng)報(bào)道了在放射抗性癌細(xì)胞中cirRNA的差異表達(dá)[38]。雖然目前乳腺癌還沒有廣泛開展PYK2B基因的circRNA研究，但是本文研究表明，PYK2B基因的circRNA很可能對(duì)乳腺癌的診斷治療起重要作用。最近的研究[39]已經(jīng)證明外泌體介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中不同類型細(xì)胞之間的相互作用，它們調(diào)節(jié)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥性(通過轉(zhuǎn)運(yùn)腫瘤相關(guān)mRNA，miRNA和蛋白質(zhì))、血管生成、免疫逃逸和其他過程。PDCD6IP基因?qū)ν饷隗w的發(fā)生有著重要的調(diào)控作用，能直接介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中對(duì)腫瘤的重要調(diào)控作用。ABL1基因是一種蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和有效的致癌基因，相關(guān)研究[40]證實(shí)，它是miR-203(一種腫瘤抑制性miRNA)的真正靶標(biāo)。ABL1基因通過與miR-203結(jié)合導(dǎo)致miR-203腫瘤抑制能力減弱或者喪失，使正常抑制的致癌基因不受表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移。雖然ABL1基因的circRNA對(duì)乳腺癌的作用目前尚未有相關(guān)研究，但ABL1基因的circRNA極有可能作為ceRNA和“海綿吸附miRNA”參與到乳腺癌致癌的調(diào)節(jié)過程。最近的相關(guān)研究[40]證明circHIPK3可以使內(nèi)源性miR-7結(jié)合以隔離和抑制miR-7活性，從而導(dǎo)致表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達(dá)增加達(dá)到調(diào)控直腸癌生長和轉(zhuǎn)移的作用[41]。雖然尚未有EGFR基因的circRNA對(duì)乳腺癌的作用的相關(guān)研究，但本研究證明EGFR基因的circRNA很可能對(duì)乳腺癌的診斷及預(yù)后有重要作用。RhoA表達(dá)水平在多種腫瘤組織中增加并且與腫瘤惡性相關(guān)，表明RhoA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的重要作用。相關(guān)研究[42]證實(shí)miR-200b可介導(dǎo)RhoA基因以形成內(nèi)源競爭并在包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生中具有重要的調(diào)節(jié)作用。研究[42]顯示，通過多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，RhoA參與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等。RhoA基因的circRNA極有可能作為ceRNA和“海綿吸附miRNA”調(diào)控RhoA基因的表達(dá)并參與到乳腺癌致癌的調(diào)節(jié)過程中，并作為用于治療癌癥轉(zhuǎn)移的潛在的治療標(biāo)靶。

本文從生物信息學(xué)角度對(duì)高通測序數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘，發(fā)現(xiàn)的hubcircRNA基因及其對(duì)應(yīng)的circRNA對(duì)乳腺癌基礎(chǔ)臨床研究具有一定的參考價(jià)值。

本研究通過3種乳腺癌細(xì)胞的DNase-seq數(shù)據(jù)和ATAC-seq數(shù)據(jù)對(duì)3種乳腺癌細(xì)胞內(nèi)circRNA捕獲率的分析，發(fā)現(xiàn)DNase-seq實(shí)驗(yàn)的捕獲率及精度要高于ATAC-seq實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)捕獲的活化circRNA基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的活化circRNA基因大多參與到細(xì)胞代謝，正、負(fù)調(diào)控，細(xì)胞的凋亡、增生、分化，以及目前已證實(shí)的跟腫瘤相關(guān)的一些重要信號(hào)通路中，因此表明活化circRNA在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。本研究顯示基因編碼區(qū)包含多個(gè)circRNA，但在本研究中僅捕獲基因編碼區(qū)中對(duì)應(yīng)的部分circRNA，表明這些基因?qū)?yīng)的circRNA可能針對(duì)某些特定的miRNA作為ceRNA和“海綿吸附miRNA”參與到乳腺癌致癌的調(diào)節(jié)過程。通過對(duì)本研究識(shí)別出的hubcircRNA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因參與到了腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中，這表明hubcircRNA在此過程中起重要作用，雖然目前尚未廣泛研究這些hubcircRNA對(duì)乳腺癌的作用，但本研究的結(jié)果表明這些hubcircRNA可能作為用于治療癌癥轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。