鈄方芳 簡 艷 郭善嫻 蔡 云 陳小丹 郭昌瑩

肺癌是中國乃至全世界腫瘤發(fā)病率和死亡率最高的癌種[1]，手術(shù)和放化療是其傳統(tǒng)的治療模式，但5年生存率不足15%[2]。靶向治療的出現(xiàn)使肺癌的5年生存率提高至17%以上[3]。多數(shù)患者就診時(shí)即為中晚期。放化療及靶向治療不僅能殺傷癌細(xì)胞，對機(jī)體正常細(xì)胞和免疫系統(tǒng)也有一定的損害。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，免疫治療取得重大突破，尤其是免疫檢查點(diǎn)抑制劑(PD-1)的上市，顯著提高晚期肺癌的生存期[4]，提取患者外周血培養(yǎng)DC疫苗和細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(cytokine induce killer,CIK)免疫治療出現(xiàn)的副反應(yīng)輕微，療效可，是值得深入探索的重要治療方案，尤其是晚期體質(zhì)欠佳肺癌患者的解救措施[5]。

本研究從細(xì)胞和分子水平研究癌基因的腫瘤抗原性，在目前成熟技術(shù)的DC疫苗免疫治療基礎(chǔ)上，將Her-2基因通過慢病毒載體方式轉(zhuǎn)染重組DC基因組，使其持續(xù)在DCs中表達(dá)，探索其對淋巴細(xì)胞的激活功能及對Her-2陽性肺癌細(xì)胞株的免疫抗腫瘤效果，改善DC疫苗抗腫瘤治療的瓶頸問題，為進(jìn)一步探索新的高效的腫瘤治療方式奠定充分的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和癌株

pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro、pMD2.G、pMDL-G/P-RRE、pRSV-REV(Biocat公司)；pcDNA3.1-ERBB2-EGFP(香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院贈)；人胚腎細(xì)胞株293FT、大腸桿菌Top 10(香港中文大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院贈)，細(xì)胞株(A549肺腺癌、H460大細(xì)胞肺癌、H1299肺腺癌、H441肺腺癌，H2170肺鱗癌，HCC827非小細(xì)胞肺癌，均由本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶NotI、XbaI、T4 DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)；DNA凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)；DNA marker、PCR試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA凝膠回收試劑盒(天根公司)；IL-2(雙鷺公司)；IFN-γ(華新公司)；CD3(Biolegend)；GM-CSF、IL-4、TNF-α(Peprotech)； CerBb-2兔單克隆抗體(福州邁新)；CD83 APC、CD86 FITC、HLA-DR PERCP、CD1α PE、CD3 FITC、CD56 PE(BD Biosciences)；CCK8試劑盒(南京建成)。

1.3 ERBB2慢病毒載體構(gòu)建及其表達(dá)

根據(jù)Her-2基因片段設(shè)計(jì)引物，上游引物1：5'GAAGATTCTAGAATGGAGCTGGCGGCCTTG3'，在5'端引入Xba I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；下游引物2：5'GAAGGAGCGGCCGCCCTCACACTGGCACGTCCAGA3'，在5'端引入Not I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基；ERBB2長度：3768 bp。PCR條件設(shè)置為：94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min 30 s，循環(huán)32個(gè)周期，擴(kuò)增ERBB-2基因片段，瓊脂凝膠回收試劑盒提取PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增的Her-2基因片段與慢病毒質(zhì)粒連接室溫下孵育2.5 h構(gòu)建慢病毒載體(LV-Her2載體)，熱休克法轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)菌，收集單克隆菌落后,復(fù)蘇Lenti-X-293T細(xì)胞，按接種密度5×105個(gè)/ml置于15 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿面積為90%時(shí)，以1∶9的比率進(jìn)行傳代。取2× HBS13.5 ml，0.25MCaCl2溶解液13.5 ml，TE buffer 12.2 ml，包裝質(zhì)粒pMD 2.0 95 μg，pMDL-G/P-RRE 176 μg，pRSV-REV 68 μg，病毒質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro-Her2 270 μg，渦旋混勻。加入均勻鋪滿約40%的293T中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。16 h后更換新的培養(yǎng)液22.5 ml。再次孵育30 h后，收集含病毒的上清液，800 rpm，離心10 min。用0.45 μm的過濾網(wǎng)過濾。同時(shí)每400 μl的慢病毒上清液加入100 μl的PEG-itTM配制，1 500 rpm，離心30 min，上清液多次離心收集慢病毒載體。檢測病毒滴度。

1.4 疫苗制備

用含有肝素的抗凝管收集人外周血30 ml， 加入含F(xiàn)icoll的離心管，反復(fù)離心后取單個(gè)核細(xì)胞的白膜層進(jìn)行培養(yǎng)，以1.5×106個(gè)/ml的接種密度分裝入3個(gè)T25培養(yǎng)瓶中，每瓶共有培養(yǎng)基約6 ml，記為A、B、C。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱2 h，向三個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加入 IL-4，GM-CSF和30 μl血漿作DC培養(yǎng)。第5天分別向B和C加入空載體LV和LV-Her2轉(zhuǎn)染DC，取MOI=10，病毒劑量=MOI×細(xì)胞數(shù)/滴度(TU/ml)×1000。第6天加入TNF-α 12 μl，第8天觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞刷刮出細(xì)胞，1 200 rpm，離心5 min，計(jì)數(shù)：0.6×106個(gè)/ml，流式細(xì)胞學(xué)測三組培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的CD83/86/1α和HLA-DR的表達(dá)情況，評估DC疫苗的成功率。

CIK疫苗制備：計(jì)數(shù)新培養(yǎng)瓶A1，B1，C1細(xì)胞數(shù)為：0.9×106個(gè)/ml，同時(shí)加入IFN-γ，CD3pure、血漿進(jìn)行CIK培養(yǎng)。分別隔天計(jì)數(shù)CIK數(shù)量，補(bǔ)液至密度1.5×106個(gè)/ml。在CIK培養(yǎng)的第8天加入DC對照組疫苗、LV-DC空載體組疫苗、LV-Her2-DC實(shí)驗(yàn)組疫苗(計(jì)數(shù)CIK∶DC為10∶1)，進(jìn)行DC-CIK疫苗培養(yǎng)，第14天收集CIK，取少量CIK調(diào)整密度為105個(gè)/ml，流式細(xì)胞儀測三組細(xì)胞表面CD3/56表達(dá)情況，評估CIK疫苗的成功率。

1.5 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

將三組DC疫苗誘導(dǎo)的CIK分別接種于96孔板中，每孔105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液為100 μl/孔，設(shè)置6復(fù)孔，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中48 h。每孔加入10%總體積的CCK8試劑，置于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h，450 nm波長下測量OD值。評估三組DC疫苗誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力。

1.6 免疫組化篩選表達(dá)Her-2的肺癌細(xì)胞株

將已消毒好的玻片放置在10 cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存的A549肺腺癌、H460大細(xì)胞肺癌、H1299肺腺癌、H441肺腺癌，H2170肺鱗癌，HCC827非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，按接種密度為2×105個(gè)/ml進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。免疫組化法評估各個(gè)細(xì)胞株Her-2表達(dá)能力。篩選Her-2表達(dá)能力最強(qiáng)的細(xì)胞株進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)。

1.7 DC-CIK殺傷肺癌細(xì)胞的效率

將篩選出表達(dá)Her-2的A549肺癌細(xì)胞接種在96孔板中，每孔數(shù)量為：5×103個(gè)，培養(yǎng)液體積為：100 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。按效靶比分別為10∶1、20∶1、40∶1的比率加入三組DC疫苗誘導(dǎo)的CIK中進(jìn)行體外殺傷，每組設(shè)置3復(fù)孔。效靶細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，加入10 μl CCK8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，450 nm下酶標(biāo)儀測量每孔的OD值。殺傷率計(jì)算公式如下：殺傷率=[1-(效靶實(shí)驗(yàn)孔OD-效應(yīng)細(xì)胞孔OD)/靶細(xì)胞孔OD]×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)對比實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異，隨機(jī)區(qū)組方差分析比較多組變量之間的差異，定義P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Her-2基因克隆PCR結(jié)果

利用PCR成功擴(kuò)增出pcDNA3.1-ERBB2-EGFP質(zhì)粒中需要的ERBB2基因片段(圖1)

M為DNAladder；PCR為加入引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物；Con為原始質(zhì)粒。

2.2 感受態(tài)菌落中重組質(zhì)粒Her-2基因鑒定

電泳可見感受態(tài)菌落中有含Her2基因的質(zhì)粒(見圖2)。

M為DNAladder；PCR為加入引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物；Con為原始質(zhì)粒。

2.3 病毒滴度測定

隨著稀釋程度的增加，可見熒光顯像細(xì)胞數(shù)遞減(圖3)。

圖3 熒光顯微鏡下慢病毒感染293T細(xì)胞圖像

2.4 DC疫苗、DC-CIK細(xì)胞培養(yǎng)

單個(gè)核細(xì)胞在細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)下貼壁生長，邊界逐漸不整齊并有小的突起，加入TNF-α后突起明顯，外形如樹突狀形態(tài)；在IFN-γ、CD3和IL-2誘導(dǎo)下分化為懸浮生長的CIK，細(xì)胞逐漸增大，可見集落，胞膜光滑無突起，胞質(zhì)內(nèi)有分泌顆粒。

2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染DC疫苗情況

取MOI=10，空載體病毒和LV-Her2轉(zhuǎn)染DC效率分別為40.2%和41.8%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.293)。

2.6 三組DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR的流式檢測結(jié)果(表1)

表1 三組DC疫苗表面分子表達(dá)情況

2.7 三組DC疫苗誘導(dǎo)制備CIK后表面分子CD3/56的流式檢測結(jié)果(表2)

表2 三組DC-CIK疫苗表面分子CD3/56的表達(dá)情況

2.8 各組DC疫苗刺激CIK增殖結(jié)果(表3)

CCK8法檢測CIK增殖情況，發(fā)現(xiàn)LV-Her2-DC實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)CIK增殖明顯增強(qiáng)，明顯高于LV-DC空載體組和單純DC對照組，方差分析發(fā)現(xiàn)三組CIK增殖情況并不完全相同(P=0.00)。LV-DC組與單純DC組CIK增殖無明顯差異(P=0.06)，LV-Her2-DC實(shí)驗(yàn)組明顯高于單純DC對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。

表3 三組CIK增殖能力比較

2.9 肺癌細(xì)胞株免疫組化結(jié)果

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：A549肺癌細(xì)胞胞膜染色呈弱而不完整的著色，根據(jù)Her-2診斷標(biāo)準(zhǔn)，Her-2免疫組化結(jié)果為+。余細(xì)胞株未見明顯著色。

2.10 CCK8檢測CIK對腫瘤細(xì)胞的殺傷率結(jié)果

分別將三組DC-CIK加入A549肺癌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)，鏡下發(fā)現(xiàn)DC-CIK體型小且呈圓形，A549貼壁生長，外觀大呈不規(guī)則形態(tài)，共培養(yǎng)48 h后發(fā)現(xiàn)DC-CIK浸潤在A549腫瘤細(xì)胞周圍，A549肺癌細(xì)胞破裂死亡，且效靶比越高，A549肺癌細(xì)胞死亡越明顯。三組DC-CIK在不同效靶比下殺傷率有差異(P=0.003)，其中空載體組與DC-CIK疫苗殺傷效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.654)，見表4。

表4 三組CIK對A549的殺傷率/%

注：P為不同效靶比下LV-Her2-DC-CIK實(shí)驗(yàn)組與單純DC-CIK對照組對A549腫瘤細(xì)胞殺傷能力差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 討論

肺癌細(xì)胞表達(dá)多種特異性癌抗原，是具有免疫原性的惡性腫瘤[6]。其中，DCs作為機(jī)體最強(qiáng)大的抗原專職遞呈細(xì)胞，能夠高表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合物，具有免疫刺激能力，能高效激活初始型T細(xì)胞，在機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。體外培養(yǎng)DC疫苗回輸體內(nèi)可彌補(bǔ)腫瘤微環(huán)境中免疫系統(tǒng)的抑制，誘發(fā)且增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷腫瘤，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。除外傳統(tǒng)的單純DC疫苗，還有抗原肽或全腫瘤抗原致敏的DC疫苗，將特異性腫瘤抗原或全腫瘤抗原負(fù)載在DCs表面，誘導(dǎo)機(jī)體針對某一特定抗原或含有某一抗原物質(zhì)的細(xì)胞進(jìn)行殺傷[7]。

近年來，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)性抗原可作為內(nèi)源性抗原分子被機(jī)體抗原遞呈細(xì)胞識別，以Ⅰ類MHC-多肽的形式遞呈至淋巴細(xì)胞誘發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴反應(yīng)(cytotoxic lymphocyte，CTL)或在胞內(nèi)加工處理后以Ⅱ類MHC-多肽的形式遞呈誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。目前已證實(shí)的癌基因如K-ras[5]、p53[8-9]、MAGE-A3[10]、CK19[11]等表達(dá)蛋白均可誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，是潛在的靶向抗原基因。有文獻(xiàn)報(bào)道Her-2蛋白在胃癌、乳腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中均有較高表達(dá)[12]，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織中Her-2蛋白表達(dá)率高達(dá)20%～30%[13]，Her-2突變率高達(dá)4%左右[14]。曲妥珠單抗可明顯改善乳腺癌和胃癌Her-2高表達(dá)患者的生存期，然而對肺癌Her-2陽性患者療效并不佳[15]。從免疫學(xué)角度設(shè)想，如果增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞對Her-2的捕獲能力，提高CD8+等效應(yīng)T細(xì)胞對Her-2陽性腫瘤的識別和殺傷效果，提高機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到殺傷腫瘤細(xì)胞以及清除潛伏轉(zhuǎn)移病灶的作用。因此，我們以Her-2基因?yàn)榘袠?biāo)，通過慢病毒載體導(dǎo)入DC抗原遞呈細(xì)胞來增強(qiáng)Her-2的表達(dá)量，增強(qiáng)靶抗原的提呈能力，提高機(jī)體免疫系統(tǒng)識別能力，從而建立起一條新的針對肺癌驅(qū)動基因表達(dá)的治療途徑來評估其殺瘤效應(yīng)。

有學(xué)者利用慢病毒載體將MAGE-A3基因重組于DCs中，制作能持續(xù)表達(dá)MAGE-A3蛋白的DC疫苗，發(fā)現(xiàn)其能高效的誘發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)并能殺死表達(dá)MAGE-A3癌細(xì)胞，進(jìn)一步支持本研究的可行性[10]。我們通過慢病毒載體將Her-2全基因組整合入慢病毒質(zhì)粒中，獲取攜帶Her-2基因的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染DCs制備表達(dá)該抗原的DC疫苗。本研究證實(shí)，空載體轉(zhuǎn)染DC與單純DC比較，流式細(xì)胞學(xué)顯示DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)空載體病毒和Her-2慢病毒載體DC轉(zhuǎn)染效率分別可達(dá)到40.2%和41.8%，兩組載體轉(zhuǎn)染效率無明顯差異(P=0.29)，未見DCs漂浮死亡等現(xiàn)象發(fā)生，提示當(dāng)MOI為10時(shí)，慢病毒轉(zhuǎn)染后DC生長不受影響且攜帶Her-2基因的慢病毒顆粒不降低感染能力，證實(shí)Her-2慢病毒載體可有效的感染DCs。同時(shí)發(fā)現(xiàn)利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將特異性基因片段重組于DC疫苗基因組可內(nèi)源性高效持久的表達(dá)腫瘤抗原表位，激活CTL免疫應(yīng)答，且能有效的克服HLA限制，可批量性生產(chǎn)[10]。結(jié)合Her-2基因潛在的腫瘤抗原性，我們利用基因工程技術(shù)將其整合至DC基因組，制備可持續(xù)表達(dá)Her-2的DC疫苗，使之能持久高效的表達(dá)腫瘤抗原，同時(shí)還刺激DC疫苗本身和體內(nèi)其它DCs的成熟，增強(qiáng)了腫瘤抗原遞呈能力，激活機(jī)體建立抗腫瘤免疫應(yīng)答能力，并重建T細(xì)胞免疫功能，為肺癌等多種Her-2陽性的腫瘤患者探索一條新的治療途徑。

臨床上用于被動免疫治療的淋巴細(xì)胞主要有：LAK細(xì)胞、CIK疫苗、NK細(xì)胞和CD3AK細(xì)胞等。其中，CIK可同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，兼具NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤和T淋巴細(xì)胞的高效抗性特點(diǎn)，同時(shí)CIK增殖速度快、抗凋亡和殺瘤能力不受細(xì)胞耐藥性影響。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DCs刺激CIK后的過繼免疫療法明顯比單純的DC疫苗主動免疫治療或單純的CIK過繼免疫治療對腫瘤的殺傷率要高[16]，故本研究選用CIK作為腫瘤殺傷T淋巴細(xì)胞。DCs誘導(dǎo)CIK增殖反應(yīng)結(jié)果顯示：Her-2基因修飾的DCs激發(fā)CIK增殖活化能力明顯高于單純DCs和空載體DCs(P=0.003)，提示LV-Her2-DC疫苗在體外能有效的誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化增殖。而空載體DCs和單純DCs激發(fā)CIK增殖活化相比較并未表現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.654)，進(jìn)一步證實(shí)慢病毒載體不損害DC功能。流式細(xì)胞學(xué)檢測CIK表型發(fā)現(xiàn)均表達(dá)CD3/CD56，與多數(shù)研究中得到的慢病毒轉(zhuǎn)染后DCs并不改變DCs及CIK本身功能結(jié)果相似，包括不影響DCs和CIK的成熟分化[17-18]。

Her-2蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要角色，主要參與肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤的MARK和PI3K信號傳導(dǎo)途徑，因此，本研究以Her-2為靶基因，建立一條新的細(xì)胞免疫抗腫瘤途徑。在實(shí)驗(yàn)中Her-2表現(xiàn)出強(qiáng)烈的自體異源性，刺激CIK活化增殖，約為單純DC刺激CIK誘導(dǎo)細(xì)胞活化及數(shù)量增殖能力的2倍，為殺傷腫瘤細(xì)胞打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。繼曲妥珠單抗有效應(yīng)用于乳腺癌和胃癌的治療以來，一系列以Her-2為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略相繼被建立，包括靶向Her-2抗原肽負(fù)載DC的主動免疫治療，我們構(gòu)建的Her-2慢病毒載體在轉(zhuǎn)染DCs后，可將Her-2片段重組于DCs基因組內(nèi)，表達(dá)的Her-2蛋白被內(nèi)源性遞呈誘發(fā)CTL反應(yīng)，同時(shí)Her-2的整個(gè)cDNA可能含有其它未知的抗原決定簇，同時(shí)遞呈識別發(fā)揮最大限度的DCs免疫抗原遞呈功能；再次，DCs表面持續(xù)表達(dá)的Her-2抗原能持續(xù)的刺激DCs，克服MHC-抗原肽復(fù)合物降解對其產(chǎn)生的損傷。

本研究以弱表達(dá)Her-2蛋白的A549肺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明效靶比越高，腫瘤殺傷率越高，Her-2慢病毒轉(zhuǎn)染組殺傷率明顯高于空載體轉(zhuǎn)染組和單純DC組(P<0.05)，而空載體組與對照組殺傷率并未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)區(qū)別(P=0.654)，再次證實(shí)Her-2修飾的DC疫苗的有效性和高效性。

綜上所述，構(gòu)建特異性表達(dá)Her-2的慢病毒載體感染DCs后，可通過有效的遞呈腫瘤抗原來高效激活淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫應(yīng)答，在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺瘤效果。這一結(jié)果為建立針對非小細(xì)胞性肺癌的特異性靶向免疫治療方案提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，基于免疫細(xì)胞在體內(nèi)和體外環(huán)境中存在的功能差異和干擾因素問題，LV-Her2轉(zhuǎn)染DCs作為疫苗治療非小細(xì)胞性肺癌還有待于通過嚴(yán)格設(shè)計(jì)的臨床實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。期望以后能通過進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件，獲取更加完善的研究結(jié)果，為建立更有效治療肺癌的臨床方法提供更加有效、合理的依據(jù)。