汪 矗 李 科 石少卿 李 敏

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其中約85%是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[1]。NSCLC常診斷在患癌晚期，且患者的5年總生存率非常低[2]。癌細(xì)胞的葡萄糖代謝方式主要依靠糖酵解而不是三羧酸循環(huán)，由于癌細(xì)胞的快速生長會消耗大量的葡萄糖[3-5]，因此機(jī)體會通過糖酵解的逆反應(yīng)-糖異生途徑為癌細(xì)胞不斷地提供葡萄糖。

CRTC2是CREB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的共激活因子，能夠促進(jìn)肝臟的糖異生反應(yīng)[6-7]。Shi等[8]發(fā)現(xiàn)CRTC2能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的體外遷移和增殖能力。Li等[9]發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者的CRTC2及其突變后的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常人群。

本研究發(fā)現(xiàn)CRTC2在非小細(xì)胞肺癌患者癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁，且與糖異生關(guān)鍵酶G6Pase和PEPCK的表達(dá)顯著正相關(guān)，能夠增加NSCLC大鼠的血糖水平、促進(jìn)糖異生反應(yīng)并減少細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的機(jī)制驗證發(fā)現(xiàn)miR-451是參與CRTC2促糖異生發(fā)生的關(guān)鍵因子，CRTC2通過CREB結(jié)合在miR-451的啟動子區(qū)并抑制miR-451的轉(zhuǎn)錄活性，提高miR-451靶基因Gyk及其下游G6Pase和PEPCK的表達(dá)水平，從而促進(jìn)NSCLC的糖異生途徑，這為NSCLC的發(fā)生提供新的理論依據(jù)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

20只非小細(xì)胞肺癌大鼠模型購自廣州賽業(yè)生物公司；葡萄糖、丙酮酸和胰島素購自美國sigma公司；CRTC2蛋白、參與糖異生途徑的G6Pase 、PEPCK和Gyk蛋白及內(nèi)參β-actin抗體均購自美國Abcam公司；干擾CRTC2的慢病毒載體、miR-451 mimic、miR-451 inhibitor及pcDNA3.1-CRTC2質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司；Tunel凋亡試劑盒、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光素酶活性檢測試劑盒均購自美國promega公司。染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購自美國milippore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)本采集 選取本院2015年至2018年收治住院的70例非小細(xì)胞肺癌患者，其中男性42例、女性28例；年齡40～70歲，中位年齡57歲；肺鱗癌30例、肺腺癌32例、腺鱗混合癌8例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)和細(xì)胞學(xué)證實為非小細(xì)胞肺癌；肝腎功能、血象正常。

1.2.2 非小細(xì)胞肺癌大鼠的處理 將0.2 ml滴度為1×109的陰性對照(sh-Ctr)、干擾CRTC2(sh-CRTC2)慢病毒載體及miR-451抑制劑通過尾靜脈注射至非小細(xì)胞肺癌大鼠，注射后第五天檢測糖異生途徑相關(guān)指標(biāo)變化。

1.2.3 葡萄糖代謝檢測 葡萄糖代謝檢測包括葡萄糖耐量實驗(GTT)、丙酮酸耐受實驗(PTT)和胰島素耐受實驗(ITT)。對于GTT和PTT實驗，大鼠禁食6小時后腹腔注射2 g/kg體重的葡萄糖和丙酮酸；對于ITT實驗，大鼠禁食4 h后腹腔注射1單位/kg體重的胰島素，采用血糖測量儀檢測大鼠的血糖濃度。

1.2.4 實時定量PCR檢測 采用貼壁細(xì)胞RNA提取試劑盒提取非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，熒光定量PCR檢測CRTC2、miR-451、G6Pase、PEPCK和Gyk的表達(dá)水平。各檢測基因的QPCR引物見表1。QPCR結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。

1.2.5 western blot檢測 向A549細(xì)胞中加入RIpA蛋白裂解液，至4 ℃離心機(jī)以12 000 rpm離心10 min，吸取上清加入4倍體積的SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min。 取30 μg的蛋白裂解液加入8% SDS-PAGE凝膠中分別以60 V和100 V電壓進(jìn)行蛋白濃縮和分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，以10%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入兔抗大鼠CRTC2、G6Pase、PEPCK和Gyk抗體，4 ℃過夜孵育后，ECL發(fā)光液顯色。

1.2.6 miR-451 mimic及pcDNA3.1-CRTC2轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 A549細(xì)胞接種至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%,每孔轉(zhuǎn)染5微升的miR-451 mimic和陰性對照NC，轉(zhuǎn)染24 h后，再轉(zhuǎn)染入1 μg的pcDNA3.1-CRTC2質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測A549細(xì)胞中CRTC2、miR-451、G6Pase、PEPCK和Gyk糖異生途徑相關(guān)指標(biāo)的變化。

表1 QPCR檢測引物

1.2.7 TUNEL染色檢測A549細(xì)胞凋亡 A549細(xì)胞經(jīng)miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，采用4%多聚甲醛固定。再利用TUNEL試劑盒檢測A549細(xì)胞的凋亡個數(shù)，定量結(jié)果采用TUNEL陽性細(xì)胞核占總細(xì)胞核的百分比表示。

1.2.8 熒光素酶報告載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 采用MEME在線預(yù)測miR-451啟動子上游2000 bp的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)-1121 bp處存在CREB的結(jié)合位點。從人基因組中釣取miR-451啟動子片段，并構(gòu)建入pGL3-basic載體中。帶酶切位點的引物為Kpn I-miR-451-F：GGTACCTTTAGCTGAAACCGTTGA，Nhe I-miR-451-R：GCTAGCGTAGCGTTGTGATGGATC，構(gòu)建成功后提取質(zhì)粒，命名為pGL3-Wt。miR-451啟動子上CREB位點的缺失突變由上海生工公司合成，采用DNA合成技術(shù)合成不含有CREB結(jié)合位點的miR-451啟動子，并將此序列克隆至pGL3-basic載體，命名為pGL3-Mut。實驗組將pGL3-Wt或pGL3-Mut與pRL-TK載體共轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞中，對照組轉(zhuǎn)染pGL3-basic與pRL-TK，每孔轉(zhuǎn)染劑量為2 μg。轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細(xì)胞并采用promega熒光素酶分析儀檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，兩者比值為熒光素酶的相對活性。

1.2.9 染色質(zhì)免疫共沉淀 取出生長至90%以上的細(xì)胞，加入37%多聚甲醛，室溫交聯(lián)10 min后，加入甘氨酸終止交聯(lián)。將細(xì)胞培養(yǎng)基吸出，加入預(yù)冷的PBS潤洗兩次后，將細(xì)胞刮下并4 ℃下以2 000 rpm離2 min，收集細(xì)胞沉淀加入SDS Lysis Buffer后進(jìn)行超聲破碎。將超聲后的細(xì)胞分為3組：input組、IgG陰性對照組和加anti-CRTC2抗體組。4 ℃過夜孵育后，于每組加入proteinA磁珠，孵育2 h后洗滌沉淀復(fù)合物。將洗滌后的DNA片段用于QPCR分析，設(shè)計miR-451啟動子-1121位點的QPCR引物，上游：5'-AGCATGTAGACTGCTGGGGCAA-3'；下游：5'-CCTGCAGTAGGTTTCTGCTGCCTTG-3'。以input為內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpadprism 6.05軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)，單因素方差分析One-Way ANOVA和Student'st檢驗進(jìn)行差異比較分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRTC2、miR-451及糖異生途徑關(guān)鍵酶在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)水平

CRTC2、G6Pase和PEPCK在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁(P<0.01)，與之相反，miR-451在NSCLC患者腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁(P<0.01)。pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)70例NSCLC患者的CRTC2與G6Pase和PEPCK的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別為0.4815和0.2723；CRTC2與miR-451的表達(dá)水平則呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01，γ=-0.608)。以上結(jié)果表明，糖異生途徑可能影響NSCLC的發(fā)生，CRTC2表達(dá)水平與糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK及miR-451存在明顯關(guān)聯(lián)。

2.2 CRTC2通過抑制miR-451表達(dá)影響NSCLC大鼠的葡萄糖代謝

設(shè)計和構(gòu)建干擾CRTC2的慢病毒載體sh-CRTC2和miR-451 抑制劑，并通過尾靜脈注射NSCLC大鼠和葡萄糖耐量實驗(GTT)、丙酮酸耐受實驗(PTT)、胰島素耐受實驗(ITT)檢測CRTC2和miR-451是否參與NSCLC大鼠的葡萄糖代謝。如圖1A-1C所示，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)三段CRTC2干擾片段中，sh-CRTC2-2的干擾效果最佳，且干擾CRTC2導(dǎo)致miR-451的表達(dá)水平顯著升高，而糖異生途徑關(guān)鍵酶G6Pase和PEPCK的表達(dá)明顯降低；注射miR-451 inhibitor挽救了被sh-CRTC2抑制的G6Pase和PEPCK表達(dá)水平，提示CRTC2上調(diào)糖異生途徑關(guān)鍵基因G6Pase和PEPCK的表達(dá)可能是通過抑制miR-451。與sh-Ctr對照組相比，干擾CRTC2導(dǎo)致NSCLC大鼠飼喂?fàn)顟B(tài)和空腹?fàn)顟B(tài)下的血糖水平顯著下降，而miR-451 inhibitor的注射緩解了血糖的下降程度，見圖1D。PTT實驗表明sh-CRTC2的NSCLC大鼠新生肝糖原水平低于sh-Ctr組，而miR-451 inhibitor使肝糖原生成水平明顯上升；ITT實驗顯示干擾CRTC2的表達(dá)導(dǎo)致血糖水平降低，而注射miR-451 inhibitor緩解了血糖下降趨勢，提示NSCLC大鼠對胰島素的敏感性與CRTC2和miR-451的表達(dá)有關(guān)，兩者分別發(fā)揮著促進(jìn)和抑制的作用；GTT實驗表明干擾CRTC2導(dǎo)致外源葡萄糖的消耗更加迅速，明顯快于sh-Ctr組大鼠，因此導(dǎo)致血糖水平降低的更快，注射miR-451 inhibitor挽救了血糖水平的降低趨勢，使其回升的血糖水平明顯高于sh-CRTC2組，見圖1E-1G。

注：圖1A-1B表示CRTC2三段干擾序列在NSCLC肺癌組織中的干擾效果；圖1C表示CRTC2和miR-451 inhibitor對G6Pase和PEPCK RNA水平的影響；圖1D表示空腹和喂食狀態(tài)的NSCLC大鼠的血糖水平受到CRTC2干擾和miR-451 inhibitor的影響；圖1E-1G分別表示CRTC2干擾和miR-451 inhibitor影響PTT、ITT和GTT實驗下的NSCLC大鼠血糖水平。

2.3 CRTC2/miR-451軸通過促進(jìn)糖異生途徑抑制細(xì)胞凋亡

本研究采用Tunel凋亡實驗檢測NSCLC細(xì)胞A549在經(jīng)受miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2轉(zhuǎn)染后的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比NC對照轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染miR-451 mimic促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡，而Gyk、PERCK和G6Pase的表達(dá)受到抑制；在轉(zhuǎn)染miR-451 mimic的基礎(chǔ)上再次轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CRTC2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨轉(zhuǎn)染miR-451 mimic相比，A549的細(xì)胞凋亡個數(shù)減少，且受miR-451抑制的Gyk、PERCK和G6Pase表達(dá)水平明顯回升，見圖2A-2D，以上結(jié)果證明miR-451能夠抑制糖異生途徑并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而CRTC2減弱了miR-451對糖異生的抑制作用，及其引起的A549細(xì)胞凋亡。

A和B表示A549細(xì)胞凋亡實驗的檢測結(jié)果；C和D表示western blot和QPCR檢測miR-451 mimic和pcDNA3.1-CRTC2轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞中miR-451靶基因Gyk及下游PERCK和G6Pase的表達(dá)水平。

2.4 CRTC2抑制miR-451的分子機(jī)制

我們采用hTTP://meme-suite.org/數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測miR-451上游2 000 bp啟動子序列，發(fā)現(xiàn)-1121 bp處存在CREB的結(jié)合序列。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗發(fā)現(xiàn)，干擾CRTC2導(dǎo)致CREB與miR-451啟動子-1121 bp處的結(jié)合能力明顯下降，見圖3。將大小為2000 bp的miR-451啟動子克隆至pGL3-basic載體，重組載體命名為pGL3-Wt，CREB位點缺失突變的miR-451啟動子重組載體命名為pGL3-Mut。熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示pGL3-Mut的雙熒光素酶活性明顯高于pGL3-Wt，而干擾CRTC2導(dǎo)致pGL3-Wt和pGL3-Mut的雙熒光素酶活性明顯高于sh-Ctr對照組，表明miR-451啟動子-1121 bp處的CREB結(jié)合序列是CRTC2抑制miR-451轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵位點，突變此位點序列或干擾CRTC2都能夠增強(qiáng)miR-451啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的代謝重編程，被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的標(biāo)志之一，在過去的十年中，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)的代謝途徑逐漸被報道，如戊糖磷酸途徑、絲氨酸甘氨酸途徑和糖酵解途徑[10-12]，但與糖酵解相逆的糖異生途徑卻鮮有報道。糖異生途徑是機(jī)體中的非碳水化合物碳源如乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油等物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘?葡萄糖或糖原)的過程，在空腹或饑餓狀態(tài)下，機(jī)體主要依靠糖異生途徑維持正常血糖濃度。這致使糖酵解或糖異生反應(yīng)會不可避免地造成細(xì)胞的代謝壓力，進(jìn)而導(dǎo)致癌細(xì)胞的代謝重編程受損[13-16]。因此，糖酵解或糖異生途徑作為代謝重編程的治療靶點對癌細(xì)胞的生長和生存至關(guān)重要。

A表示ChIP實驗驗證-1121位置的結(jié)合位點與CRTC2和CREB轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的結(jié)合能力；B表示熒光素酶實驗驗證干擾CRTC2對miR-451野生型及突變型的啟動子活性的影響。

CRTC2作為人體血糖調(diào)節(jié)的開關(guān)性蛋白，在正常情況下，以磷酸化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)接收活化信號，CRTC2迅速去磷酸化并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中與CREB蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)糖異生途徑。CRTC2與癌癥發(fā)生的相關(guān)報道較少，F(xiàn)ang等[17]的研究發(fā)現(xiàn)CRTC2是淋巴瘤抑制因子，能通過轉(zhuǎn)錄DNA得錯配修復(fù)來保持基因組的完整性；Brown等[18]發(fā)現(xiàn)CRTC2通過調(diào)節(jié)芳香化酶，影響更年期和肥胖相關(guān)得荷爾蒙環(huán)境，并在肥胖和乳腺癌之間建立聯(lián)系。此外，Li等發(fā)現(xiàn)CRTC2及其突變體在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。以上報道提示CRTC2作為調(diào)節(jié)糖異生途徑的關(guān)鍵因子亦可能參與癌癥的發(fā)生。本研究通過對70例非小細(xì)胞肺癌患者癌和癌旁組織的定量分析，發(fā)現(xiàn)CRTC2在NSCLC癌組織中的表達(dá)明顯高于高旁，這與Li的報道一致。不僅如此，CRTC2與糖異生關(guān)鍵酶G6Pase和PEPCK的在腫瘤組織中的表達(dá)均高于癌旁，且與CRTC2呈顯著正相關(guān)，表明CRTC2在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的表達(dá)水平可能影響糖異生途徑。

腫瘤細(xì)胞中的miR-451處于失調(diào)狀態(tài)，能通過靶向抑制多個分子發(fā)揮促癌或抑癌的作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-451在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)降低，而上調(diào)miR-451能夠增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌對放療和順鉑化療的敏感性[19-20]，表明miR-451對NSCLC的發(fā)展發(fā)揮著抑制作用。而在高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和肥胖小鼠肝臟中，miR-451表達(dá)上升，表明其參與肝臟的代謝紊亂[21-22]。Shu等[23]發(fā)現(xiàn)miR-451是糖異生反應(yīng)的上游抑制因子，能夠靶向抑制Gyk的表達(dá)從而進(jìn)一步阻遏AKT-FOXO1-PEPCK/G6Pase 通路。本研究發(fā)現(xiàn)miR-451在NSCLC癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與CRTC2的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，推測miR-451可能與CRTC2共同參與NSCLC的發(fā)生。為證實此猜想，進(jìn)一步的研究利用干擾CRTC2的慢病毒載體和miR-451抑制劑通過尾靜脈注射至NSCLC大鼠模型中，通過QPCR和葡萄糖耐量實驗(GTT)、丙酮酸耐受實驗(PTT)和胰島素耐受實驗(ITT)證實缺乏CRTC2導(dǎo)致miR-451表達(dá)上升，且降低空腹和飽腹?fàn)顟B(tài)下NSCLC大鼠的血糖水平，而miR-451 inhibitor在降低miR-451表達(dá)的同時，亦挽回了CRTC2缺陷大鼠的血糖下降趨勢，使其血糖水平高于僅注射sh-CRTC2的NSCLC大鼠，表明CRTC2/miR-451軸具有穩(wěn)定NSCLC大鼠血糖水平的功能。

已有的研究證實敲除肺癌細(xì)胞中的PERCK能夠增強(qiáng)葡萄糖耗竭誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，miR-451能夠靶向調(diào)節(jié)Gyk控制PERCK的表達(dá)[23]，提示miR-451不僅能夠抑制糖異生途徑，還能通過下調(diào)PERCK引起細(xì)胞凋亡。為證實CRTC2通過糖異生途徑影響非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的進(jìn)程，本研究通過向A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-451 mimic、過表達(dá)CRTC2(pcDNA3.1-CRTC2)的載體以及細(xì)胞凋亡實驗，發(fā)現(xiàn)miR-mimic導(dǎo)致A549凋亡細(xì)胞增加，而lv-CRTC2則抑制了miR-mimic的促凋亡作用。進(jìn)一步，通過western blot和QPCR發(fā)現(xiàn)CRTC2阻遏了miR-451對Gyk的靶向抑制，表現(xiàn)為Gyk及其下游的G6Pase和PEPCK表達(dá)升高，由于PEKCK參與葡萄糖消耗引起的細(xì)胞凋亡，因此本研究結(jié)果表明CRTC2通過抑制miR-451的表達(dá)促進(jìn)糖異生途徑，并參與NSCLC細(xì)胞的凋亡抑制。

CRTC2作為CREB的共激活因子共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和糖異生途徑[24]。本研究采用在線分析hTTP://meme-suite.org/預(yù)測miR-451上游啟動子的-1121bp處存在CREB的結(jié)合序列。進(jìn)一步，將miR-451啟動子及其CREB位點突變序列克隆至熒光素酶報告載體，并采用ChIP檢測CRTC2與CREB的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與-1121bp位點的結(jié)合能力和miR-451啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾CRTC2明顯阻遏了其與miR-451啟動子的結(jié)合能力，并導(dǎo)致啟動子的轉(zhuǎn)錄活性升高，表明-1121bp位點對miR-451啟動子的抑制作用；進(jìn)一步的點突變實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型的miR-451啟動子活性明顯低于突變型，而在CRTC2干擾的A549細(xì)胞中，突變型啟動子的活性升高的更為明顯，表明-1121bp處的CREB結(jié)合序列是抑制miR-451啟動子活性的關(guān)鍵位點，CRTC2通過此位點抑制miR-451的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)其在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)。

綜上所述，CRTC2是參與非小細(xì)胞肺癌糖異生反應(yīng)的上游關(guān)鍵因子，通過轉(zhuǎn)錄抑制miR-451，增強(qiáng)miR-451下游Gyk、G6Pase和PEPCK的表達(dá)，并進(jìn)一步減少NSCLC細(xì)胞的凋亡，這為NSCLC的發(fā)生提供新的理論依據(jù)和作用機(jī)制。