梁晉剛，欒穎，宋新元，張正光*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176; 3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長春 130033)

自從1996年轉(zhuǎn)基因作物開始商業(yè)化種植以來，抗蟲、抗病、抗逆境、耐除草劑和品質(zhì)改良等轉(zhuǎn)基因作物相繼問世，有效地緩解了人口膨脹、資源短缺、天氣惡劣等影響糧食產(chǎn)量的問題，也使全球的農(nóng)民從中收獲巨大的經(jīng)濟(jì)收益，但轉(zhuǎn)基因作物的安全問題一直被人們密切關(guān)注，尤其是轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)存在的潛在影響[1-3]。

轉(zhuǎn)基因作物可通過其凋落物殘?bào)w或根際分泌物等影響土壤理化性質(zhì)(如土壤含水量、pH值)、微生物群落結(jié)構(gòu)及功能酶活性(如脲酶、磷酸酶)，從而在一定程度上對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)程產(chǎn)生影響[1,4-5]。因此，研究轉(zhuǎn)基因作物的種植對(duì)土壤主要理化性質(zhì)和功能酶活性的影響對(duì)于完善轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)體系具有重要意義[2]。

培育新型抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米，對(duì)于延緩害蟲抗性、提高玉米產(chǎn)量、增加農(nóng)民收入具有重要意義。利用植物的偏好密碼子，重新設(shè)計(jì)和改造Cry1Ab基因并獲得新型抗蟲基因Cry1Ab-Ma，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Cry1Ab-Ma基因轉(zhuǎn)入玉米鄭58中，獲得的轉(zhuǎn)基因玉米CM8101具有較好的抗蟲性[6-7]。已有研究表明，轉(zhuǎn)基因玉米CM8101對(duì)白符跳的存活率，赤子愛勝蚓的存活率、體重變化量、蚓繭量和孵化幼蚓量均無顯著影響[8]。本文對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101根際土壤主要理化性質(zhì)和功能酶活性進(jìn)行了2年的監(jiān)測(cè)，以期為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101的環(huán)境安全性提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為轉(zhuǎn)Cry1Ab-Ma基因抗蟲玉米CM8101(CM)和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩奏?8(CMCK)，2種試驗(yàn)材料均由研發(fā)單位中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及土壤采集

試驗(yàn)時(shí)間為2017—2018年，試驗(yàn)地點(diǎn)位于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境安全研究試驗(yàn)圃。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)品種設(shè)置3次重復(fù)。試驗(yàn)期間采用當(dāng)?shù)仄胀ㄞr(nóng)事管理操作。

2年的土壤樣品都在苗期(SS)、花期(FS)和成熟期(MS)3個(gè)生育期采集，3次采樣時(shí)間均為每年的6月10日、7月15日、10月10日左右。采用五點(diǎn)取樣法，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)(不同生育期的取樣點(diǎn)保持一致)，去除表層土后將作物根部上的土抖落作為根際土均勻地混在一起，然后用四分法取土，過2 mm篩子后放自封袋于-20 ℃保存以待后續(xù)研究[2]。

1.3 土壤主要理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.1 土壤含水量的測(cè)定

土壤含水量使用烘干稱重法測(cè)定[9]。將采集的新鮮土樣放在105 ℃的烘箱里烘干至恒重，再用公式計(jì)算含水量：含水量=(濕土質(zhì)量-干土質(zhì)量)/干土質(zhì)量×100%。

1.3.2 土壤pH的測(cè)定

土壤的pH利用電極法來測(cè)定[10]。先稱取10 g風(fēng)干土樣和25 mL蒸餾水于100 mL三角瓶中，充分搖勻后靜置30 min后，再用pH計(jì)測(cè)定土壤懸液的酸堿度。

1.4 土壤主要功能酶活性的測(cè)定

1.4.1 土壤脲酶活性的測(cè)定

利用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定脲酶水解尿素后產(chǎn)生的NH3-N，來測(cè)定土壤脲酶的活性。土壤脲酶活性的測(cè)定采用Solarbio公司的土壤脲酶活性測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：BC0125)?；钚詥挝坏亩x：每天每克土壤中產(chǎn)生1 μg NH3-N定義為1個(gè)酶活單位。

1.4.2 土壤酸性磷酸酶活性的測(cè)定

利用可見分光光度法，通過酸性磷酸酶催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，測(cè)定酚的生成量可以計(jì)算出土壤酸性磷酸酶的活性。土壤酸性磷酸酶活性的測(cè)定采用Solarbio公司的土壤酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：BC0140)?；钚詥挝坏亩x：37 ℃中每克土壤每天釋放1 nmol酚為1個(gè)酶活單位。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)通過SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多處理間差異采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan氏多重比較。另外，在不同生育期、不同品種間、不同種植年份間，選擇單因素方差分析對(duì)土壤主要理化性質(zhì)和功能酶活性進(jìn)行差異顯著性分析[1]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤主要理化性質(zhì)的變化

如圖1所示，2017年和2018年轉(zhuǎn)基因玉米CM8101(CM)根際土壤在3個(gè)生育期的含水量與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58(CMCK)對(duì)比，沒有顯著性差異；如圖2所示，2017年和2018年轉(zhuǎn)基因玉米CM8101根際土壤在3個(gè)生育期的pH值與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58對(duì)比，沒有顯著性差異。

A—2017年；B—2018年。同生育期柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～4同。圖1 轉(zhuǎn)基因玉米CM8101和鄭58根際土壤含水量

通過ANVOA分析可以看出(表1)，2年中不同的玉米品種對(duì)含水量和pH均無顯著性影響；不同的生育期和年份會(huì)顯著性地影響到含水量和pH值，其中，含水量在不同年份間的F值為29.782、P值為0.000，pH值在不同年份間的F值為9.958、P值為0.003。但在2017年，pH值在各生育期間無顯著性差異。進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101的種植對(duì)根際土壤的含水量和pH值均無顯著性影響，并且發(fā)現(xiàn)不同種植年限和作物生育期是影響根際土壤主要理化性質(zhì)的主要因素。

2.2 土壤主要功能酶活性的變化

如圖3所示，2017年和2018年轉(zhuǎn)基因玉米CM8101(CM)根際土壤在3個(gè)生育期的脲酶活性與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58(CMCK)對(duì)比，沒有顯著性差異；如圖4所示，2017年和2018年轉(zhuǎn)基因玉米CM8101根際土壤在3個(gè)生育期的酸性磷酸酶活性與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58對(duì)比也都沒有顯著性差異。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米CM8101和鄭58根際土壤pH值

表1 含水量、pH值與年份、生育期和品種的ANOVA比較分析

注：*表示達(dá)顯著水平(P<0.01)。表2同。

通過ANVOA分析可以看出(表2)，2年中不同的玉米品種對(duì)脲酶和酸性磷酸酶活性均無顯著性影響；不同的年份會(huì)顯著性地影響脲酶和酸性磷酸酶活性，其中，脲酶在不同年份間的F值為137.631、P值為0.000，酸性磷酸酶在不同年份間的F值為39.294、P值為0.000。進(jìn)一步說明轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101的種植對(duì)脲酶和酸性磷酸酶活性均無顯著性影響，并且發(fā)現(xiàn)不同種植年份是影響根際土壤主要功能酶活性的主要因素。

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米CM8101和鄭58根際土壤脲酶活性

圖4 轉(zhuǎn)基因玉米CM8101和鄭58根際土壤磷酸酶活性

表2 酶活性與年份、生育期和品種的ANOVA比較分析

3 討論

轉(zhuǎn)基因作物的種植對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響尚無定論，而土壤又是植物、土壤動(dòng)物、土壤微生物等物質(zhì)交換和能量流動(dòng)的重要場(chǎng)所。本文以轉(zhuǎn)Cry1Ab-Ma基因抗蟲玉米CM8101和對(duì)照非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58為試驗(yàn)材料，進(jìn)行了為期2年的田間試驗(yàn)，采集根際土壤樣品后測(cè)定了3個(gè)生育期的主要理化性質(zhì)(含水量和pH值)和功能酶活性(脲酶和酸性磷酸酶)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101的種植不會(huì)對(duì)土壤主要理化性質(zhì)和功能酶活性產(chǎn)生顯著性影響，且在已知范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)不同生育期和種植年份是影響土壤主要理化性質(zhì)和功能酶活性的主要因素。本文研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101的環(huán)境安全性提供了可靠數(shù)據(jù)支持。

3.1 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101種植對(duì)土壤主要理化性質(zhì)的影響

土壤理化性質(zhì)是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[11]，然而在種植轉(zhuǎn)基因作物后，其根系分泌物或其外源物質(zhì)在土壤中殘留，都可能會(huì)改變土壤理化性質(zhì)。已有的研究表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻華恢1號(hào)的種植對(duì)土壤pH值無顯著性影響[12]；轉(zhuǎn)Bt基因水稻(克螟稻)根系分泌物中有機(jī)酸(主要為酒石酸)的含量顯著降低，導(dǎo)致作物根系土壤pH值顯著性升高[13]；轉(zhuǎn)入木質(zhì)素過氧化物酶和α-淀粉酶基因后的紫花苜蓿會(huì)產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)，降低枝葉重量、提高氮和磷的含量，進(jìn)而其種植會(huì)導(dǎo)致土壤pH值升高[14]；我們此前的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91和轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米IE09S034的種植對(duì)土壤含水量和pH值均無顯著性影響[1-2]。因此，轉(zhuǎn)基因作物的種植對(duì)土壤主要理化性質(zhì)的影響，應(yīng)當(dāng)采取個(gè)案分析的原則，具體問題具體分析。

3.2 轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米CM8101種植對(duì)土壤主要功能酶活性的影響

已有的研究表明，轉(zhuǎn)基因抗蟲耐草甘膦大豆ZB對(duì)土壤堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性無顯著影響[15]；轉(zhuǎn)Bt基因水稻種植后會(huì)導(dǎo)致土壤脲酶活性發(fā)生顯著性變化，變化幅度受土壤類型和生育期的影響[16]；轉(zhuǎn)Bt基因玉米種植前期會(huì)顯著性提高脲酶的活性，后期與非轉(zhuǎn)基因玉米的脲酶活性相比沒有顯著性差異，對(duì)磷酸酶活性一直沒有顯著性差異[17]；轉(zhuǎn)入木質(zhì)素過氧化物酶和α-淀粉酶基因后的紫花苜蓿會(huì)產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)，降低枝葉重量、提高氮和磷的含量，進(jìn)而其種植會(huì)導(dǎo)致磷酸酶的活性降低[14]；轉(zhuǎn)Bt基因水稻的殘?bào)w對(duì)土壤磷酸酶活性沒有顯著性影響[18]；我們此前的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91和轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米IE09S034的種植對(duì)土壤蔗糖酶、堿性磷酸酶、脲酶活性均無顯著性影響[1-2]。土壤中包含了多種多樣的酶，研究時(shí)有必要選取具有代表性的酶進(jìn)行分析。