張嬌嬌，李 婧，范冰倩，杜 鵬，鄭 宇，朱立磊，宋 佳*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；2.山東玉兔食品股份有限公司 山東調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，山東 淄博 255300）

食醋，也稱為醯、苦酒，通常是以高粱、大米、小麥、豌豆、水果等作為原料，酵母菌、霉菌、醋酸菌、乳酸菌等多菌種參與，固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵工藝，經(jīng)糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、陳釀而成的色香味俱全的調(diào)味品[1-2]。因?yàn)榧t曲具有良好的糖化力、酯化力和發(fā)酵力[3]，可作為糖化發(fā)酵劑釀造紅曲米醋。其酸中微甘，醋味醇厚，色澤棕紅，澄清透亮，深受人們喜愛[4]。紅曲米醋是通過加入烏衣紅曲進(jìn)行糖化及酒精發(fā)酵，烏衣紅曲中的多種微生物、發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物及其在制備過程中的變化等對(duì)紅曲米醋的風(fēng)味、品質(zhì)具有重要作用[5]。目前國(guó)外對(duì)于紅曲米醋的研究較少，而國(guó)內(nèi)也多集中于紅曲米醋釀造工藝、紅曲米醋功效成分之一——洛伐他汀含量測(cè)定方法和提高洛伐他汀含量工藝優(yōu)化以及通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究其降低血脂、降血壓、抗氧化等功能[6-8]，但是有關(guān)紅曲米醋中紅曲的過程以及過程中微生物變化研究較少，因此了解紅曲米醋制曲過程中微生物群落變化，對(duì)科學(xué)地研究紅曲米醋制曲過程微生物菌群代謝和紅曲米醋品質(zhì)提升具有重要意義。

曲微生物分析傳統(tǒng)采用平板分離培養(yǎng)的方法，但是實(shí)驗(yàn)室條件下能夠培養(yǎng)分離出的微生物僅占樣品的1%～10%[9]，因此免培養(yǎng)分離方法，如實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-fluorescent quantitative-polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gel gradient electrophoresis，PCR-DGGE）、16S/18Sr核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）基因克隆文庫(kù)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）等在近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于傳統(tǒng)食醋釀造過程中微生物群落的分析[10]，但是存在成本高、檢測(cè)不到豐度小于1%的種群、操作繁瑣等問題[11-13]。而高通量測(cè)序技術(shù)能從微生物基因水平獲取群落資源，具有通量高、效率高、測(cè)序快、覆蓋率高等優(yōu)點(diǎn)[14-18]，可較為全面的分析微生物群落信息。

本研究通過高通量測(cè)序方法研究紅曲米醋制曲過程微生物群落演替，同時(shí)分析測(cè)定了制曲過程曲的糖化力、液化力、酯化力、淀粉酶活力、蛋白酶活力等生化指標(biāo)，采用典范對(duì)應(yīng)分析（canonical correspondence analysis，CCA）深度解析制曲過程微生物群落變化對(duì)曲生化指標(biāo)的影響，找出主要功能微生物，為進(jìn)一步篩選功能微生物提供理論支撐，同時(shí)為曲質(zhì)量?jī)?yōu)劣的評(píng)判、曲的強(qiáng)化、制曲工藝的優(yōu)化提供依據(jù)，以提升紅曲米醋的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

紅曲米醋釀造用紅曲：山東玉兔食品有限責(zé)任公司；黑曲霉（Aspergillus niger）、紅曲霉（Monascus purpureus）、酵母（Saccharomyces）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）：天津科技大學(xué)微生物制藥研究室保藏菌種；大米（有機(jī)糙米）：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

乙酸鉀、乙酸銨、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic aid，EDTA）、氯仿、異丙醇、乙醇（均為分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、可溶性淀粉（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；福林試劑、酪蛋白、Tris-HCl、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CATB）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；引物：蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP1502電子分析天平：上海奧豪斯儀器有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式電動(dòng)離心機(jī)：上海安亭儀器廠；DK-8D電熱恒溫水浴箱：鞏義予華儀器有限公司；nexus GX2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國(guó)Eppendorf公司；ChemiDocTMXRS+凝膠分析儀：美國(guó)Bio Rad公司；WS2-134-75恒溫培養(yǎng)箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；HYG-W1回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；1500全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)THERMO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲米醋制備工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

大米選擇：選擇顆粒飽滿、色澤清白透明、無(wú)灰塵雜質(zhì)的大米。

浸泡：按1∶2～1∶4（g∶mL）料液比加水浸泡10～15 h，溫度控制在25～30 ℃。

蒸煮液化：將上述浸泡大米煮沸20～30 min后，降至50～60 ℃后加入0.02%～0.04%（V/V）的耐高溫淀粉酶，在70～90 ℃溫度下液化20～30 min。

紅曲制備：

前泡曲：將紅曲種、黑曲種、蒸熟已冷卻大米、水按（0.5～1.0）∶（0.01～0.03）∶（1～2）∶（3～4）混合后于28～30 ℃泡曲4～6 d，制得紅曲醪；制曲：將紅曲醪以3%～5%的接種量接種于蒸熟已冷卻大米，于30～40 ℃、60%～70%濕度條件下培養(yǎng)4～6 d，當(dāng)感官上呈現(xiàn)紅與黑所占比例分別為60%～80%、20%～40%時(shí)，即可制成烏衣紅曲；后泡曲：將制備的烏衣紅曲放入罐中，加入4～6倍水于28～30 ℃浸泡2～3 d，備用。

酒精發(fā)酵：將液化后的漿液冷卻至28～30 ℃，補(bǔ)充糖度達(dá)到15～18°Bé后無(wú)菌條件下接入8%～12%的烏衣紅曲醪液，溫度控制在28～30 ℃條件下發(fā)酵至酒精度為8%vol～10%vol，制得小米紅曲酒醪。

醋酸發(fā)酵：取過濾后的酒液，以4%～8%的接種量接入醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，溫度控制在35～37 ℃，通風(fēng)量為0.05～0.10 m3/min，發(fā)酵至酸度達(dá)到6～8 g/100 mL時(shí)終止發(fā)酵，制得原醋。

陳釀熟化：將制得原醋室溫陳釀1～3年，陳釀熟化的醋液加入新鮮果汁和蜂蜜調(diào)配，得到優(yōu)質(zhì)紅曲米醋。

1.3.2 曲生化指標(biāo)分析

紅曲米醋制曲過程中糖化力、液化力的測(cè)定依據(jù)文獻(xiàn)[19-20]中的淀粉水解法；酯化力采用輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》；蛋白酶活依據(jù)商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》；淀粉酶活按照國(guó)標(biāo)GB/T 5521—2008《糧油檢驗(yàn)谷物及其制品中α-淀粉酶活性的測(cè)定》中的比色法測(cè)定。其中，在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U/g）；在40 ℃下，以每克樣品每5 min生成1 mg麥芽糖定義為1個(gè)淀粉酶活力單位（U/g）。

1.3.3 宏基因組總DNA提取

按文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改，即取制曲過程24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)樣品（制曲總時(shí)間為96 h），五點(diǎn)法取曲樣混合后，從中取1 g樣品放入4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌研缽中，加入液氮快速研磨至粉末狀，然后加入脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提液和5%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，放入65 ℃恒溫水浴鍋溫浴2 h，然后加入乙酸鉀，放于4 ℃冰箱1 h，1000 r/min離心5 min取上清，加入苯酚-氯仿-異丙醇（25∶24∶1，V/V）混合液，1 000 r/min離心5 min取上清，加入乙酸銨-異丙醇（24∶1，V/V）混合液1 000 r/min離心5 min取沉淀，用4 ℃預(yù)冷乙醇漂洗3次后，室溫放置1 h至乙醇揮發(fā)，加入ddH2O 50 μL溶解沉淀，得到基因組。

1.3.4 紅曲高通量測(cè)序的方法

以紅曲總DNA為模板，進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域擴(kuò)增，真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）區(qū)段克隆測(cè)序和序列特征比較分析。細(xì)菌16S rRNA基因通用引物[22]：27F（5'-AGA GTT TGA T（C/T）（A/C）TGG CTC AG-3'），1492R（5'-TAC CTT GTT A（C/T）G ACT T-3'）；真菌ITS序列通用引物：NSA3（5'-AAA CTC TGT CGT GCT GGG GAT A-3'），NLC2（5'-GAG CTG CAT TCC CAA ACA ACT C-3'。

細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液5 μL；三磷酸脫氧核糖核苷（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）mix 4 μL；引物1：2 μL；引物2：2 μL；MgCl2：3 μL；模板：2 μL；Taq酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min，94 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃1 min 30s，72 ℃15 min，2～4步30個(gè)循環(huán)。

真菌ITS測(cè)序及PCR擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液：5 μL；dNTP mix 4 μL；引物1：2 μL；引物2：2 μL；MgCl2：3 μL；模板：2 μL；Taq酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃2 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，72 ℃15 min，2～4步30個(gè)循環(huán)。

各取PCR產(chǎn)物5 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)合格樣品進(jìn)行送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

Illumina MiSeq測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)通過Fastqc 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)去除低質(zhì)量Reads，然后通過COPE軟件，進(jìn)行序列拼接及過濾處理，去除嵌合體序列，得到有效序列后進(jìn)行聚類分析，每一個(gè)聚類稱為一個(gè)物種操作單元（operational taxonomic units，OTU），對(duì)于相似性≥97%（RDP classifier貝葉斯算法）的序列劃分為同一個(gè)OTU，進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)，其中每個(gè)OTU代表一個(gè)物種[23]。利用Qiime2軟件和核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）中的Classifier算法，擇置信度閾值≥0.9，對(duì)OTU序列進(jìn)行物種注釋和豐度分析[19]。基于OTU進(jìn)行物種的Alpha多樣性分析、樣本間的Beta多樣性比較分析等，基于分類學(xué)信息，進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析。

3.運(yùn)用科學(xué)決策新技術(shù)，推動(dòng)大數(shù)據(jù)治理創(chuàng)新。大數(shù)據(jù)是信息文明的產(chǎn)物和必然結(jié)果。當(dāng)前，隨著大數(shù)據(jù)國(guó)家戰(zhàn)略的穩(wěn)步推進(jìn)，政府治理迫切需要直接面對(duì)大數(shù)據(jù)、全面基于大數(shù)據(jù)和創(chuàng)新應(yīng)用大數(shù)據(jù)，以提升決策科學(xué)化、智能化水平。要運(yùn)用大數(shù)據(jù)技術(shù)揭示傳統(tǒng)技術(shù)方式難以展現(xiàn)的關(guān)聯(lián)關(guān)系，提升政府整體理性認(rèn)知水平，從而促使治理目標(biāo)定位更準(zhǔn)確，治理政策、治理方式和手段更加符合客觀事實(shí)，治理進(jìn)程和治理成效更加滿足社會(huì)期待。要推動(dòng)政府?dāng)?shù)據(jù)開放共享，促進(jìn)社會(huì)事業(yè)數(shù)據(jù)融合和資源整合，并應(yīng)用大數(shù)據(jù)技術(shù)開發(fā)這些數(shù)據(jù)資源，為有效處理復(fù)雜社會(huì)問題提供新的手段，推動(dòng)政府治理模式進(jìn)步。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品至少3次重復(fù)數(shù)據(jù)，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析和Tukey's 相關(guān)性分析，采用Origin85軟件作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，顯著性差異以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)。CCA分析采用CAVOCOV45軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲的生化指標(biāo)分析[25]

紅曲米醋制曲過程曲生化指標(biāo)分析結(jié)果見表1。由表1可知，隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶活力、酯化力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并均于72 h達(dá)到最高，分別為（21.70±0.07）U/g和（109.58±4.02）U/g；曲的糖化力、液化力、淀粉酶活力均呈逐漸增高趨勢(shì)，可能與曲中微生物生長(zhǎng)變化有關(guān)，如已有研究表明黑曲霉、米曲霉、紅曲霉等霉菌屬可產(chǎn)生豐富蛋白酶、淀粉酶、酯化酶，促進(jìn)原料中淀粉、蛋白、脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)水解，以及一些有機(jī)酸和乙醇的合成[26]，而酵母菌可利用糖類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，水解及發(fā)酵過程溫度及小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的提升，一方面促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，提供更豐富的糖化及發(fā)酵所需酶類的同時(shí)，進(jìn)一步促進(jìn)發(fā)酵過程，對(duì)紅曲米醋產(chǎn)品的風(fēng)味和品質(zhì)有重要作用，這與李光永等[27-29]研究結(jié)果一致。

表1 紅曲米醋制曲過程生化指標(biāo)分析結(jié)果Table 1 Analysis results of biochemical indexes during koji making process of red roji rice vinegar U/g

2.2 制紅曲過程中真菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及多樣性分析

2.2.1 制紅曲過程中真菌的Alpha多樣性分析[30-32]

對(duì)制曲過程的4個(gè)時(shí)間段樣品真菌進(jìn)行測(cè)序分析，共得到192 505條有效序列，聚類分析結(jié)果顯示共有28個(gè)QTU數(shù)，各組分別有14、25、20、16個(gè)QTU數(shù)。

制曲過程中4個(gè)時(shí)間段樣品真菌Alpha多樣性的分析結(jié)果見表2。由表2可知，Coverage指數(shù)均＞99.9%，表明測(cè)序深度已覆蓋大部分物種，可以真實(shí)展示樣品中的絕大多數(shù)真菌；隨著制曲時(shí)間的增加，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在72 h時(shí)達(dá)到最高分別為42.167和38.667，表明制曲過程真菌總數(shù)隨制曲時(shí)間增加而增加，72 h時(shí)曲中真菌總數(shù)最多，隨后真菌總數(shù)減少，可能是隨著制曲時(shí)間延長(zhǎng)，微生物不斷生長(zhǎng)，消耗較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而導(dǎo)致真菌總數(shù)降低；隨著制曲時(shí)間的增加，Shannon指數(shù)呈先降后增趨勢(shì)，而Simpson指數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)折點(diǎn)均在48 h，為0.703，體現(xiàn)制曲過程48 h時(shí)，樣品真菌的多樣性最高，表明可能由于隨著制曲時(shí)間的增長(zhǎng)，曲中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少、環(huán)境pH變化、優(yōu)勢(shì)菌的生長(zhǎng)以及微生物代謝物質(zhì)對(duì)其本身生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[33-35]，造成真菌數(shù)量和多樣性下降。

表2 真菌多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table 2 Results of fungal diversity index analysis

2.2.2 制紅曲過程中真菌菌群結(jié)構(gòu)演替分析

由圖1B可知，在屬水平上共有16種，其中曲霉屬（Aspergillus）、酵母屬（Saccharomyces）和紅曲霉屬（Monascus）可占80%以上，而畢赤酵母屬（Pichia）和未分類（Unclassified）也占較大相對(duì)豐度，分別為0.03%～17.34%、0.25%～18.35%；此外青霉屬（Penicillium）、季也蒙酵母屬（Meyerozyma）、擬盤多毛孢菌屬（Clavispora）、根霉屬（Rhizopus）、毛孢子菌屬（Trichosporon）、赤霉菌屬（Gibberella）等菌屬也參與制曲過程，占比為12.5%以下。制曲前期（24 h、48 h）Saccharomyces、Monascus為優(yōu)勢(shì)菌，總占分別為比為80.13%和75.29%，后期（72h和96h）優(yōu)勢(shì)菌變?yōu)锳spergillus，占比為66.79%、61.35%，即隨著制曲時(shí)間的增加，Monascus、Rhi zopus、鐮胞菌（Eurotium）、Gibberella等屬相對(duì)豐度逐漸降低，Aspergillus、Penicillium、Trichosporon等相對(duì)豐度逐步增加，而Saccharomyces呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最高?？赡苁怯捎跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，使得對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)格菌的降低，同時(shí)酵母菌會(huì)利用糖類產(chǎn)酒精，從而導(dǎo)致部分菌的死亡。酵母屬利用糖類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酒，紅曲霉屬和曲霉屬可產(chǎn)生豐富的淀粉酶、蛋白酶、酯化酶，尤其是曲霉屬有較一定的耐醇能力[27]，影響用于釀造紅曲米醋的紅曲糖化力、發(fā)酵產(chǎn)酒能力以及紅曲米醋的產(chǎn)量、色澤和風(fēng)味。

圖1 門（A）和屬（B）水平真菌的相對(duì)豐度分析Fig.1 Relative abundance analysis of fungal at the phylum (A) and genus (B) level

2.2.3 制紅曲過程中真菌的Beta多樣性分析[36]

Beta多樣性主成分分析（principal component analysis，PCA）通過分析不同樣本OTU（97%相似性）組成可以反映樣品的差異和距離，樣品間距離越近，表示相似度越高，反之，差異度越大[37]。制曲過程的4個(gè)時(shí)間段樣品中真菌Beta多樣性分析結(jié)果見圖2。

圖2 屬水平真菌的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of fungus at the genus level

由圖2可知，用PCA分析直觀呈現(xiàn)紅曲米醋制曲過程不同時(shí)間點(diǎn)曲樣本的相似及差異性。制曲時(shí)間24 h和48 h樣品距離較遠(yuǎn)，表明二者組成差異性較大，而制曲時(shí)間72 h和96 h的樣品距離較近，表明這兩個(gè)樣品組成相似度較高。隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，樣本的相似性逐漸增加，曲中真菌組成逐漸趨于穩(wěn)定，穩(wěn)定于以曲霉屬、酵母屬、紅曲霉屬為主要真菌屬，可能與制曲后期酒精濃度有關(guān)，而而這三種真菌均有一定耐酒精特性。

2.3 制紅曲過程中細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及多樣性分析

2.3.1 制紅曲過程中細(xì)菌的Alpha多樣性分析

對(duì)制曲過程的4個(gè)時(shí)間段樣品細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序分析，共得到153 918條有效序列，聚類分析結(jié)果顯示共有41個(gè)OTU數(shù)，各組分別為27，40，33，34個(gè)OTU數(shù)，樣品的細(xì)菌多樣性如表3所示。

表3 細(xì)菌多樣性指數(shù)分析結(jié)果Table 3 Results of bacterial diversity index analysis

由表3可知，Coverage指數(shù)均大于99.9%，表明測(cè)序深度已覆蓋大部分物種，可以真實(shí)展示樣品中的絕大多數(shù)細(xì)菌；隨著制曲時(shí)間的增加，Chao1指數(shù)逐漸降低、Ace指數(shù)先減后增再降低現(xiàn)象，整體呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，表明樣品細(xì)菌總數(shù)呈逐漸降低趨勢(shì)，最低分別22.398和17.0；Shannon指數(shù)呈先增后降趨勢(shì)，于48 h達(dá)到最高為1.745，而Simpson指數(shù)處于先降后增趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最低點(diǎn)為0.459，表明在制曲過程中，制曲48 h時(shí)細(xì)菌多樣性達(dá)到最高，隨后降低，可能與真菌生長(zhǎng)有一定抑制作用關(guān)系，如紅曲霉菌、釀酒酵母對(duì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)會(huì)抑制作用[38]，從而造成細(xì)菌總數(shù)及多樣性的下降。

2.3.2 制紅曲過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)演替分析

由圖3A可知，基于門水平細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Acti nobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）及其他門細(xì)菌，其中厚壁菌門和變形菌門相對(duì)豐度分別為64.79%～96.98%，0.87%～35.00%，二者相對(duì)豐度和占總相對(duì)豐度的97.5%以上，隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，厚壁菌門呈先增后減的趨勢(shì)，48 h達(dá)到最高相對(duì)豐度為96.98%，而變形菌門與之相反，先減后增，48 h相對(duì)豐度最低，為0.87%，可能與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、環(huán)境pH變化以及微生物相互作用有關(guān)系[39-40]。

由圖3B可知，基于屬水平的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸菌屬（Acetobacter）、小球菌屬（Pediococcus）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）以及普雷沃菌屬（Prevotella）等，其中乳酸桿菌屬（厚壁菌門）所占比例最高，為63.54%～94.98%，且隨著制曲時(shí)間的增加，呈先增后降趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最高，可達(dá)94.98%?？赡芘c乳酸菌一致處于優(yōu)勢(shì)菌，且可利用糖類生長(zhǎng)并生產(chǎn)乳酸，且由于其細(xì)胞壁特殊結(jié)構(gòu)可耐受較高的乙醇濃度[41]，對(duì)紅曲、紅曲酒以及紅曲醋質(zhì)量起到關(guān)鍵作用；桿菌屬與乳酸桿菌屬趨勢(shì)一致，且桿菌屬可產(chǎn)生較高的淀粉酶、蛋白酶促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)成分的水解及利用，但是酵母屬以及紅曲霉菌屬對(duì)其有抑制作用，從而造成其先增后降趨勢(shì)，而醋酸菌屬、泛菌屬、小球菌屬、魏氏菌屬（Weissella）呈逐漸下降趨勢(shì)，其他菌屬[1]均有不同程度變化，可能與其他微生物相互作用結(jié)果，具體相互作用有待進(jìn)一步研究。

圖3 門（A）和屬（B）水平細(xì)菌的相對(duì)豐度分析Fig.3 Relative abundance analysis of bacteria at the phylum (A) and genus (B) level

2.3.3 制紅曲過程中細(xì)菌的Beta多樣性分析

由圖4可知，制曲24 h和48 h樣品距離較遠(yuǎn)，表明二者組成差異較大，而72 h與96 h樣品距離較近，表明二者組成相似度較高。與真菌PCA分析結(jié)果相似，隨著制曲時(shí)間的延長(zhǎng)，樣本的相似性逐漸增加，曲中微生物以乳酸菌為主，組成逐漸趨于穩(wěn)定，乳酸菌具有較高的耐醇能力以及產(chǎn)生乳酸與發(fā)酵過程種酯類物質(zhì)結(jié)合，提升紅曲酒及紅曲醋的品質(zhì)。

圖4 屬水平細(xì)菌的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of bacteria at the genus level

2.4 典范對(duì)應(yīng)分析

采用典范對(duì)應(yīng)分析解析紅曲米醋制曲過程中微生物群落對(duì)曲生化指標(biāo)的影響，以期找出曲的主要功能微生物與生化指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)果如圖5所示，菌屬與生化指標(biāo)垂直距離遠(yuǎn)近代表影響作用的小大，真菌對(duì)紅曲生化影響效果為：Penicillium、Meyerozyma、Aspergillus＞Clavispor、Trichosporon＞Saccharomyces、Monascus。這與文獻(xiàn)報(bào)道的Aspergillus、Monascus等曲霉，可產(chǎn)豐富的蛋白酶、肽酶、糖化酶和酯酶，Penicillium也產(chǎn)生豐富的酶系相一致[42-43]，同時(shí)Saccharomyces和Meyerozyma等酵母屬在酒精發(fā)酵中有重要作用[44]；同時(shí)，Aspergillus和Penicillium作為紅曲中主要真菌屬相對(duì)豐度可達(dá)71.36%，對(duì)紅曲生化指標(biāo)影響最為顯著（P＜0.05）。此外，Aspergillus、Monascus、Penicillium等屬分解產(chǎn)生氨基酸、酯類物質(zhì)以及有機(jī)酸、Monascus產(chǎn)的紅曲色素、Pichia、假絲酵母屬（Candida）等生香酵母對(duì)曲的色澤風(fēng)味乃至紅曲米醋的品質(zhì)有很大關(guān)系[45]。

細(xì)菌屬水平菌落組成對(duì)生化指標(biāo)影響看出，對(duì)曲蛋白酶活影響菌屬為：Saccharopolyspora＞Enterococcus＞Acinetobacter、嗜糖假單胞菌屬（Pelomona）、Streptomyces＞其他；對(duì)曲酯化力、液化力影響菌屬為：Saccharopolyspora＞Enterococcus＞Acinetobacter、Pelomonas、Streptomyces＞其他；對(duì)曲淀粉酶活、液化力影響菌屬為：Saccharopolyspora＞Enterococcus＞Acinetobacter、Pelomonas、Streptomyces＞其他。主要細(xì)菌屬（相對(duì)豐度＞1%）有：Lactobacillus、Bacillus、Acetobacter、Gluconobacter，其中Lactobacillus所占比例最高，可達(dá)94.98%，但從CCA分析結(jié)果看，其與生化指標(biāo)相關(guān)性弱于Saccharopolyspora、Enterococcus、Acinetobacter、Pelomonas、Streptomyces等相對(duì)豐度＜1%的細(xì)菌屬，表明細(xì)菌對(duì)紅曲生化指標(biāo)影響甚微，但是Lactobacillus、Bacillus等屬可產(chǎn)生豐富的乳酸、檸檬酸等有機(jī)酸，可緩和紅曲米醋釀造過程中產(chǎn)生的醋酸等刺激性物質(zhì)[46]，使得食醋酸味綿長(zhǎng)、柔和可口，紅曲米醋制曲過程中微生物群落組成對(duì)紅曲及紅曲米醋風(fēng)味物質(zhì)影響有待進(jìn)一步研究。

圖5 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)與曲生化特性的典范對(duì)應(yīng)分析Fig.5 Canonical correspondence analysis of microbial community structure and biochemical indicators of koji at the genus level

3 結(jié)論

對(duì)紅曲米醋制曲過程中曲的生化性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)除蛋白酶活力、酯化力于72 h達(dá)到最高外，曲的糖化力、液化力、淀粉酶活力等均呈逐漸增高趨勢(shì)，在96 h時(shí)候達(dá)到最高，分別為（542.61±15.62）U/g、（1.02±0.04）U/g和（1.30±0.05）U/g；同時(shí)通過高通量測(cè)序?qū)t曲米醋制曲過程微生物群落多樣性的分析，共獲得16個(gè)真菌屬和16個(gè)細(xì)菌菌屬，其中Aspergillus、Saccharomyces、Monascus為主要真菌，且制曲24 h、48 h時(shí)Saccharomyces、Monascus為優(yōu)勢(shì)菌，總占比為80.13%和75.29%，而72 h及96 h時(shí)優(yōu)勢(shì)菌變?yōu)锳spergillus，占比可達(dá)66.79%、61.35%；細(xì)菌中乳酸桿菌屬所占比例最高為94.98%，且隨著制曲時(shí)間的增加，呈先增后降趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最高。采用CCA分析方法研究曲中微生物群落演替與曲生化指標(biāo)的內(nèi)在關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)真菌中Aspergillus和Penicillium作為紅曲中主要真菌（相對(duì)豐度＞1%）比例可達(dá)71.36%，對(duì)紅曲生化指標(biāo)影響最為顯著（P＜0.05）；而細(xì)菌中Lactobacillus所占比例最高，但是CCA分析結(jié)果顯示其與生化指標(biāo)的相關(guān)性較弱，而其他細(xì)菌，如Saccharopolyspora、Enterococcus、Acinetobacter、Pelomonas、Streptomyces雖然與酶活有一定相關(guān)性，但是其豐度較小，表明細(xì)菌對(duì)紅曲生化指標(biāo)影響甚微。