桑浩田 于忠芳 于成龍 張崇昊 董鵬飛 閆振貴

硫酸化銀杏葉多糖的制備及對(duì)犬細(xì)小病毒疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究

桑浩田?于忠芳?于成龍 張崇昊 董鵬飛 閆振貴*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安 271000）

本研究通過水提醇沉淀法從銀杏葉干粉中提取粗多糖，經(jīng)脫色素、除蛋白等處理得到精制銀杏葉多糖，利用氯磺酸—吡啶法制得硫酸化銀杏葉多糖，其多糖含量為68.6%，蛋白含量為2.59%，硫酸基含量為16.4%，硫酸基取代度為1.74；通過犬的體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)，研究硫酸化銀杏葉多糖對(duì)犬細(xì)小病毒活疫苗免疫反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，硫酸化銀杏葉多糖能夠不同程度的提高免疫后血清CPV抗體水平和IL-2的含量。由此表明，硫酸化銀杏葉多糖對(duì)犬細(xì)小病毒活疫苗具有免疫協(xié)同作用，這為硫酸化銀杏葉多糖作為免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

硫酸化銀杏葉多糖 犬細(xì)小病毒 抗體水平 免疫增強(qiáng)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine-Parvovirus，CPV) 感染引起的高度接觸性傳染病，主要引起犬急性出血性腸炎或新生犬急性心肌炎，對(duì)養(yǎng)犬業(yè)危害巨大[1]。目前，針對(duì)犬細(xì)小病毒病尚未發(fā)現(xiàn)非常有效的治療方法，主要依靠接種弱毒疫苗來預(yù)防該病[2]。但是，弱毒疫苗常因母源抗體干擾、免疫原性不強(qiáng)、免疫程序不合理等因素影響導(dǎo)致免疫效果不理想。為此，本試驗(yàn)試圖從尋找新型的免疫增強(qiáng)劑為突破口，探索硫酸化銀杏葉多糖對(duì)犬細(xì)小病毒弱毒疫苗的免疫協(xié)同作用。

隨著近幾年對(duì)多糖研究的不斷深入，作為銀杏葉提取物的銀杏葉多糖(Ginkgo biloba leaf polysaccharide，GBLP)，其生物學(xué)活性也引起了研究人員的濃厚興趣。銀杏葉多糖是從銀杏葉中提取出來的水溶性成分，主要由半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖醛酸等單糖以α-糖苷鍵形式連接聚合而成，現(xiàn)已證實(shí)其具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。研究表明，銀杏葉多糖可顯著增強(qiáng)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞酸性磷酸酶活性和吞噬雞血紅細(xì)胞的吞噬能力，可顯著增加荷瘤小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，有較強(qiáng)的激活非特異性免疫的功能[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的銀杏葉多糖能提高雛雞脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平和IFN-γ含量，表明銀杏葉多糖能提高機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)細(xì)胞因子的合成和釋放[4]。研究表明，經(jīng)硫酸化分子修飾后，許多中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)活性明顯增強(qiáng)[5, 6]。因此，本試驗(yàn)擬采用氯磺酸－吡啶法對(duì)銀杏葉多糖進(jìn)行硫酸化修飾，通過體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步研究硫酸化銀杏葉多糖對(duì)犬細(xì)小病毒弱毒疫苗免疫反應(yīng)的影響，以期為銀杏葉多糖的開發(fā)和綜合利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 犬細(xì)小病毒病活疫苗，碩騰公司美國林肯廠產(chǎn)品，證號(hào)：外獸藥證字(2016)11號(hào)。每頭份含犬細(xì)小病毒NL-35-D株至少107.0TCID50。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及生物制劑 無過往病史、精神狀態(tài)良好、體重相近的成年土犬，購自泰安郊區(qū)；銀杏葉粗多糖，本實(shí)驗(yàn)室制備；犬細(xì)小病毒抗體(CPVAb)酶聯(lián)分析試劑盒、犬白介素2(IL-2)酶聯(lián)分析試劑盒，購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.1.3 主要化學(xué)試劑 乙醇、三氯甲烷、過氧化氫、正丁醇、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氯磺酸、無水吡啶、等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)CR21GII, 日本日立公司)、JA1203A電子天平(上海精天電子儀器有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東濰坊醫(yī)療器械廠)、電熱恒溫水槽(型號(hào)DK-8D, 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司, 太倉精宏儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品)、QL-901漩渦震蕩儀(澳門市其林貝爾儀器制造有限公司)、WD-9406B水平搖床(沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉多糖的精制和硫酸化 稱取適量銀杏葉粗多糖，經(jīng)Sevage法除蛋白、雙氧水法除色素，并進(jìn)行透析、洗滌等處理后，獲得精制銀杏葉多糖[7]。將附有冷凝管和攪拌裝置的三頸燒瓶置鹽水-冰浴中，加入吡啶，攪拌，使之充分冷卻，用滴液漏斗慢慢加入氯磺酸2~4ml，約30~ 40min滴加完畢，燒瓶中出現(xiàn)大量淡黃色固體即為磺酰化試劑。將磺?；噭┤芙庥贒MF，加入精制銀杏葉多糖粉末0.5g，室溫?cái)嚢?0min，45℃水浴4h，反應(yīng)物于冰浴中冷卻，用3mol/L NaOH將pH調(diào)到7.0，加入3倍體積95%乙醇，4℃靜置過夜，離心分離收集沉淀，用水復(fù)溶，流水透析24h，去離子水透析48h，冷凍干燥，制得硫酸化銀杏葉多糖。

1.2.2 硫酸化銀杏葉多糖總糖和蛋白含量的測(cè)定 （1）總糖含量的測(cè)定：采用苯酚硫酸法[8]測(cè)定銀杏葉多糖的的含量。配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，準(zhǔn)確稱取20mg葡萄糖，用純水定容至100ml。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行稀釋，得到濃度梯度為30、50、100、150、200μg/ml的系列溶液。準(zhǔn)確吸取1.0ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次置于5支具塞試管內(nèi)，然后分別加入0.5ml 5%的苯酚溶液和2.5ml濃硫酸，輕搖混勻，25℃放置20min后，用分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。銀杏葉多糖中糖含量的測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)品相同，將干燥恒重后的多糖配制成溶液，按照以上方法操作，于490nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。（2）蛋白含量的測(cè)定：采用Bradford法[9]測(cè)定銀杏葉多糖中蛋白含量。用1.0mg/ml濃度的牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml的BSA標(biāo)準(zhǔn)液。分別取2ml，加入3ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，2min后，在595nm下測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。配置0.5mg/ml的多糖樣品溶液，依據(jù)上述方法測(cè)定吸光度后，代入方程計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 硫酸化銀杏葉多糖硫酸基含量及取代度的測(cè)定 用氯化鋇-明膠法。取1mol/LHCl溶解K2SO4使其濃度為1.0875mg/ml，分別吸取該溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20ml，用1mol /LHCl補(bǔ)足至0.2ml，分別加入三氯乙酸3.8ml，氯化鋇-明膠溶液1ml和明膠溶液1ml，充分混合后室溫靜置15min，用分光光度計(jì)測(cè)定混合液360nm處的吸光值，記錄各組氯化鋇-明膠組與明膠組吸光值之差，以硫酸根濃度為橫坐標(biāo)，差值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶于1mol/L HCl溶液，配成1mg/ml的溶液，100℃水浴中水解4h。取2份0.2ml水解液，同法測(cè)定氯化鋇-明膠組和單一明膠組的吸光值，計(jì)算兩組之差。將測(cè)樣差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得樣品溶液中硫酸基濃度S%。按下式計(jì)算取代度DS=(1.62×S%)/(32-1.02× S%)。

1.2.4 動(dòng)物試驗(yàn) 將8只成年健康土犬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組，每組各4只。兩組試驗(yàn)犬均接種犬細(xì)小病毒活疫苗，1頭份/只；實(shí)驗(yàn)組試驗(yàn)犬在免疫前3d、后3d注射1ml/d硫酸化銀杏葉多糖溶液(劑量為15mg/kg)，對(duì)照組試驗(yàn)犬在免疫前3d、后3d注射1ml/d生理鹽水，作為對(duì)照。分別在免疫后的0、7、14d采血，離心后取血清，-20℃冷凍保存。采樣前12h內(nèi)，試驗(yàn)犬禁食不禁水。

1.2.5 血清中CPV抗體含量的測(cè)定 按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作，分往包被的微孔中依次加入待測(cè)血清，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細(xì)小病毒抗體(CPVAb)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中抗體(CPVAb)含量。

1.2.6 血清中IL-2含量的測(cè)定 按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行操作，往包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)血清，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-2呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IL-2的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸化銀杏葉多糖的制備及測(cè)定結(jié)果

精制的銀杏葉多糖經(jīng)苯酚硫酸法測(cè)定的總糖含量約為68.6%，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定的蛋白含量為2.59%，表明銀杏葉多糖可能是一種蛋白結(jié)合型多糖；硫酸化銀杏葉多糖的硫酸基含量為16.4%，硫酸基取代度為1.74。

2.2 硫酸化銀杏葉多糖對(duì)血清CPV抗體水平的影響

由圖１看出，試驗(yàn)和對(duì)照組血清中CPV抗體水平均在免疫后7d達(dá)到高峰，然后開始下降；在免疫后的7d和14d，試驗(yàn)組血清中CPV抗體水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 硫酸化銀杏葉多糖對(duì)血清CPV抗體水平的影響

2.3 硫酸化銀杏葉多糖對(duì)血清IL-2含量的影響

由圖2可以看出，實(shí)驗(yàn)組外周血中IL-2含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在7ｄ達(dá)到高峰，然后逐漸下降；在免疫后的7d，實(shí)驗(yàn)組血清中IL-2含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而在免疫后的14d，實(shí)驗(yàn)組血清中IL-2含量與對(duì)照組相比，差異不顯著(P>0.05)。

圖2 硫酸化銀杏葉多糖對(duì)血清IL-2含量的影響

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，硫酸化銀杏葉多糖能夠不同程度的提高犬細(xì)小病毒活疫苗免疫后血清抗體和IL-2的含量，可見硫酸化銀杏葉多糖對(duì)犬細(xì)小病毒活疫苗有一定的免疫協(xié)同作用，這為硫酸化銀杏葉多糖作為免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)奠定了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（2019–10–06）

山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2016CM26）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201810434076）；

?共同第一作者

S816.76

A

1007-1733(2019)12-0004-03