趙明 蔣貽海 魏波 曲信芹

犬干擾素的中試生產(chǎn)工藝及臨床前研究

趙明①蔣貽海③魏波②曲信芹③

（①青島蔚藍(lán)生物制品有限公司 山東 青島 266114 ②青島動保國家工程技術(shù)研究中心有限公司 山東 青島 ③青島蔚藍(lán)生物股份有限公司 山東 青島）

為了探索基因工程重組犬干擾素500L發(fā)酵罐中試規(guī)模生產(chǎn)工藝的建立以及犬干擾素的臨床評價而進(jìn)行了研究；結(jié)果表明，中試生產(chǎn)得到的犬干擾素純度為98.4%，比活性為2.97×106U/mg，內(nèi)毒素含量為19IU/ml，符合產(chǎn)業(yè)化要求。

重組犬干擾素 中試 生產(chǎn)工藝

干擾素(INF)是由Isasscs等在進(jìn)行雞胚細(xì)胞流感病毒感染試驗中首次發(fā)現(xiàn)的一類能干擾和抑制病毒復(fù)制的可溶性細(xì)胞分泌物,并將其命名為干擾素(interferon,INF)。干擾素是一種多功能的細(xì)胞因子家族中的一員,由干擾素誘生劑作用于細(xì)胞膜后,可使細(xì)胞產(chǎn)生一種特異因子,這種因子和細(xì)胞DNA中的干擾素基因抑制物結(jié)合,解除了干擾素基因的抑制作用,從而合成干擾素。干擾素作用的發(fā)揮是一個復(fù)雜的過程，通過 “INF系統(tǒng)”來實(shí)現(xiàn),表現(xiàn)出一定的抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗細(xì)菌和寄生蟲等作用。隨著人們對寵物疫病防治的關(guān)注，有效預(yù)防和治療寵物病毒性疾病成為研究的重點(diǎn)。Hiummler等(1987)首先對犬的INF-α基因進(jìn)行了研究，并報道了犬INF-α基因序列。Devos K等(1992)克隆了犬INF-r基因，楊琪等(2002)克隆了犬INF-r cDNA，并用PRC/CMV2表達(dá)載體率先在鼠骨髓瘤細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),張海峰等(2005)實(shí)現(xiàn)了重組犬INF-r在大腸桿菌中的高效表達(dá)。犬干擾素?zé)o論是天然的還是重組的干擾素均具有較強(qiáng)的抗病毒能力，臨床上已經(jīng)將重組的犬干擾素應(yīng)用于防治狂犬病、犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱、犬病毒性肝炎等病毒病。

本研究將本公司構(gòu)建完成的基因工程重組犬干擾素pBV220-caIFN/ BL21(DE3)菌種，在前期完成的實(shí)驗室制備工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行中試放大，按照GMP的相關(guān)要求進(jìn)行試制，得到的犬干擾素純度為98.4%，比活性為2.97×106U/mg，內(nèi)毒素含量為19EU/ml，適合產(chǎn)業(yè)化要求。

1 材料與方法:

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株及毒株 pBV220-caIFN/ BL21(DE3)、MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞)，VSV(水泡性口炎病毒)均為本實(shí)驗室保存。

1.1.2 儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱、恒溫震蕩培養(yǎng)箱、500L發(fā)酵罐、管式離心機(jī)、大容量高速冷凍離心機(jī)、高壓勻漿細(xì)胞破碎儀、蛋白質(zhì)電泳儀、磁力攪拌器、超濾濃縮裝置、BIAO-RAD BioLogic LP層析系統(tǒng)、恒溫水浴鍋、酶標(biāo)儀

1.1.3 試劑耗材 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、氨芐青霉素、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、硫酸銨、咪唑、鱟試劑檢測試劑盒、Brandford法蛋白濃度檢測試劑盒、

1.2 方法

1.2.1 中試制備 將保存的凍干pBV220-caIFN/BL21(DE3)菌種，用無菌水混懸后，轉(zhuǎn)移至試管中37℃ 200rpm恒溫震蕩培養(yǎng)4h后劃線接種于LB Amp平板，37℃于生化培養(yǎng)箱中孵育過夜；挑單菌接種于5ml LB Amp培養(yǎng)基中37℃ 200rpm恒溫震蕩培養(yǎng)過夜作為一級種子；將活化好的pBV220-caIFN/ BL21(DE3)菌種轉(zhuǎn)接于3L LB Amp培養(yǎng)基中37℃ 200rpm恒溫震蕩培養(yǎng)過夜作為二級種子；將培養(yǎng)好的二級種子，1%接種于300L滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中30℃發(fā)酵培養(yǎng)至OD為0.6~0.8時提高溫度至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)5~6h后停止發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 菌體回收 用管式離心機(jī)12000g 100L/h離心收集菌體后用10倍體積生理鹽水混懸菌體，菌懸液用大容量高速冷凍離心機(jī)4℃ 7000rpm 15min離心收集菌泥，保存于-20℃中備用。

1.2.3 菌體破碎 將保存好的菌泥用10倍體積的PBS混懸，于磁力攪拌器上攪拌均勻后，用高壓勻漿細(xì)胞破碎儀4℃, 800-1000 Bar, 10L/h破碎三次后用大容量高速冷凍離心機(jī)4℃ 7000rpm 15min離心收集沉淀。

1.2.4 純化分離 將沉淀用變性緩沖液(6mol/L鹽酸胍，5mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris·HCl，10 mmol/L DTT，150mmol/L NaCl，pH9.0)溶解沉淀，4℃條件下，8000rpm 15min收集上清得到變性蛋白溶液，將變性蛋白溶液緩慢滴加到復(fù)性緩沖液(0.5mol/L L-Arg；2mmol/L EDTA，15%甘油；0.9mmol/L GSSG，50mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，pH8.0)中，4℃靜置48h，4℃條件下，8000rpm 15min收集上清，即為含有重組蛋白的溶液。將重組蛋白溶液加入等體積的飽和硫酸銨溶液于磁力攪拌器上攪拌均勻后室溫靜置沉降過夜，用大容量高速冷凍離心機(jī)4℃，9000 rpm，15min離心收集沉淀，沉淀用9倍體積的PBS混懸并加入1倍體積的飽和硫酸銨溶液于磁力攪拌器上攪拌均勻后室溫靜置沉降過夜后用大容量高速冷凍離心機(jī)4℃，7000rpm，15min離心收集上清；上清用0.45um的圓片膜過濾澄清后，5KD膜包超濾濃縮10倍后用PBS洗濾4次。所得濃縮液0.22um的圓片膜過濾澄清后用裝有chelating sepharose fastflow的XK26/20層析柱于BIAO-RAD BioLogic LP層析系統(tǒng)進(jìn)行分離純化，純化所得樣品用5KDA膜包超濾用PBS洗濾4次并0.22um除菌過濾后得到半成品。

1.2.5 半成品檢驗 按照生物制品規(guī)程進(jìn)行無菌檢驗和內(nèi)毒素含量測定、總蛋白濃度測定、蛋白純度分析、犬干擾素α抗病毒比活性測定、用Western-BLOT法檢測特異性。并進(jìn)行小鼠安全性試驗、實(shí)驗室犬安全性試驗及實(shí)驗室犬有效性試驗。

2 試驗結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)

表達(dá)結(jié)果SDS-PAGE分析見圖1。

2.2 無菌檢驗實(shí)驗結(jié)果

根據(jù)《中華人民共和國曾藥典》，供試品在25℃和相對濕度60%±10%條件下抽樣檢測無細(xì)菌污染。

圖1 重組大腸桿菌表達(dá)形式鑒定

M：蛋白Marker；1：未誘導(dǎo)全菌；2：誘導(dǎo)全菌 3：裂解上清；4：沉淀

圖2 重組大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物特異性分析結(jié)果

M：蛋白Marker；1：未誘導(dǎo)對照；2：復(fù)性液

2.3 內(nèi)毒素含量測定

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》，供試品在25℃和相對濕度60%±10%條件下抽樣檢測內(nèi)毒素含量均低于20IU/ml，為19IU/ml。

2.4 總蛋白濃度、純度測定

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》，干擾素半成品用Bradford法測定總蛋白濃度為0.21mg/ml，SDS-PAGE分析后灰度掃描犬干擾素純度為98.4%。

2.5 犬干擾素α抗病毒比活性測定

參考Wish-VSV檢測方法和微量細(xì)胞病變抑制法，建立MDCK-VSV體系測定重組犬干擾素α抗病毒比活性，細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞(犬腎細(xì)胞)，病毒用VSV(水泡性口炎病毒)。測定方法用以細(xì)胞病變(CPE)抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測定法。用含有10% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞接種于96孔板中，于5%CO2，37℃培養(yǎng)至單層。將干擾素樣品預(yù)稀釋1000倍，再按4倍梯度稀釋，每個梯度重復(fù)兩孔。按每孔100ul接入。18h后，換入用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基稀釋的100TCID50病毒液，同時設(shè)置不加干擾素的病毒對照組和不加干擾素及病毒的細(xì)胞對照組，待病毒對照組出現(xiàn)90%以上細(xì)胞病變時，進(jìn)行結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀(Thermo，MultiSkan FC)在570nm波長讀值。結(jié)果根據(jù)Reed-Muench法計算，活性為6.3×105U，比活性為2.97×106U/mg。

2.6 Western-BLOT特異性分析

取復(fù)性液進(jìn)行Western-blot，結(jié)果在預(yù)期大小處約23kD出現(xiàn)目的條帶，能特異性地被干擾素抗體識別，呈陽性(詳見圖2)。

2.7 小鼠安全性試驗

將30只昆明系小鼠分為3組每組10只，分為對照組、單倍劑量實(shí)驗組和10倍劑量實(shí)驗組分別注射犬干擾素后觀察14d，全部健活無異常。

2.8 實(shí)驗室犬安全性試驗

將15只比格犬分為3組每組5只，分為對照組、單倍劑量實(shí)驗組和10倍劑量實(shí)驗組分別注射犬干擾素后觀察14d，全部健活無異常。

2.9 實(shí)驗室犬有效性試驗

將15只比格犬(50~70日齡)分為3組每組5只，分為空白對照組、攻毒組和實(shí)驗組分別攻毒(劑量為1×107TCID50/只)待其出現(xiàn)明顯的臨床癥狀時用經(jīng)過上述細(xì)胞病變法檢測含有高生物學(xué)活性的重組犬α干擾素(重組犬α干擾素按40萬IU/kg體重)進(jìn)行治療，結(jié)果表明犬治愈率增加，死亡率降低。

3 討論

（1）現(xiàn)在動物干擾素在獸醫(yī)臨床應(yīng)用尚處于初級階段，通常用于緊急治療傳染性病毒病。在臨床應(yīng)用研究方面，國內(nèi)外主要研究方向為，提高表達(dá)量和比活性、延長體內(nèi)代謝半衰期、常溫保存技術(shù)、擴(kuò)大臨床適用癥范圍以及蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和改構(gòu)等。隨著犬類動物在國人生活中的伴侶作用越來越重要，加速研發(fā)適用于臨床應(yīng)用于多種犬類的干擾素生物制劑，更好的預(yù)防和治療犬類疾病越來越重要。因為動物干擾素直接生產(chǎn)成本高、效率低、種屬差異大、穩(wěn)定性差等原因，利用基因工程技術(shù)大批量生產(chǎn)高純高效干擾素是大多數(shù)研究者的首選方法，國內(nèi)研究主要集中在大腸桿菌和酵母等表達(dá)系統(tǒng)方面，建立一個制備基因工程重組犬干擾素高純高效的生產(chǎn)工藝，不僅僅可以獲得巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且具有深刻的社會效益。（2）本研究利用前期構(gòu)建好的基因工程重組犬干擾素表達(dá)菌株，在前期完成的實(shí)驗室制備工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行中試放大，按照GMP的相關(guān)要求進(jìn)行試制。本工藝采用大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)發(fā)酵培養(yǎng)得到表達(dá)犬α干擾素的菌體，經(jīng)過離心回收、洗滌后采用高壓勻漿的方式裂解菌體；將收集的包涵體通過變性復(fù)性得到的重組犬干擾素，通過鹽析、超濾濃縮、層析純化、超濾脫鹽和除菌過濾得到]=P8I7U5TR犬α干擾素半成品。整套工藝重復(fù)性好、操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定，易于大規(guī)模成產(chǎn)，得到的基因工程重組犬α干擾素純度為98.4%，比活性為2.97× 106U/mg，內(nèi)毒素含量為19EU/ml，適合產(chǎn)業(yè)化要求。按照獸用生物制品規(guī)程的要求，本文通過進(jìn)行無菌檢驗和內(nèi)毒素含量測定、總蛋白濃度測定、蛋白純度分析、犬干擾素α抗病毒比活性測定、用Western-BLOT法檢測特異性，并進(jìn)行了小鼠安全性試驗、實(shí)驗室犬安全性試驗及實(shí)驗室犬有效性試驗，結(jié)果表明基因工程重組犬α干擾素，在小鼠和比格犬上的單劑量和超劑量安全性良好，無不良反應(yīng)；在犬細(xì)小病毒病治療試驗中顯示治愈率明顯增加，死亡率明顯降低。

本研究表明該基因工程重組犬干擾素已經(jīng)具備臨床研究的基礎(chǔ)，并具備大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化商業(yè)開發(fā)的可能。

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（2019–10–01）

十三五國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目(2016YFD0501006) ；山東半島國家自創(chuàng)區(qū)發(fā)展建設(shè)基金項目

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