萬宇平 吳小勝 張瑜 杜美紅 王兆芹 馮才偉 趙正苗 何方洋*

一種金黃色葡萄球菌核酸檢測方法的建立

萬宇平①③吳小勝①③張瑜①③杜美紅②王兆芹①③馮才偉①③趙正苗①③何方洋①③*

（①北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 102206 ②北京市理化分析測試中心 ③北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心）

通過對金黃色葡萄球菌的femA基因設(shè)計兩對特異性引物，運用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)擴增基因的特定區(qū)域，探索出一種金黃色葡萄球菌的快速檢測方法。結(jié)果表明，該方法對金黃色葡萄球菌菌液檢測的最低檢出濃度為102~103CFU/Ml；使用不同濃度的金黃色葡萄球菌處理樣品，不同樣品LAMP方法檢測結(jié)果與國標方法一致，兩者符合率為100%。該方法中金黃色葡萄球菌的femA基因特異性引物及建立的LAMP方法能有效檢測食品中的金黃色葡萄球菌，操作簡單、檢測速度快、靈敏度高、特異性強，適用于不同層級的實驗室及基層單位使用。

金黃色葡萄球菌 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) 快速檢測

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)屬革蘭氏陽性菌，是人類化膿感染中最常見的食源性病原菌[1]，耐高低溫、耐高滲透，生存能力強，普遍存在于環(huán)境中，消毒等常規(guī)處理方法無法完全破壞其分泌的毒素[2]。誤食金黃色葡萄球菌污染的食品可引起腹瀉、嘔吐等食物中毒反應(yīng)，嚴重時可引起局部化膿感染，亦可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至引發(fā)敗血癥、膿毒癥等全身感染，危及生命[3-5]。據(jù)統(tǒng)計，每年我國細菌性食物中毒占食物中毒事件總數(shù)的30%~90%，中毒人數(shù)占食物中毒總?cè)藬?shù)的60%~90%，嚴重影響了人民群眾的生命健康[6]。食品中致病菌的超標也是影響我國食品出口的主要因素，每年都給我國造成了巨大的經(jīng)濟損失，同時也使我國食品在國際市場上的聲譽受損，制約了我國農(nóng)業(yè)和食品制造業(yè)的發(fā)展[7]。由于其危害性，全球各國都重視對金黃色葡萄球菌的預(yù)防監(jiān)控及檢測技術(shù)，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《GB 29921-2013食品安全國家標準食品中致病菌限量》中規(guī)定金黃色葡萄球菌的限量為100CFU/g[8]。

目前檢測金黃色葡萄球菌的主要方法有傳統(tǒng)的國標法[9]、免疫學檢測方法、分子生物學檢測等技術(shù)，這些方法靈敏性和特異性比較高，但步驟較為繁瑣，耗時長，操作復(fù)雜，大多需要昂貴的儀器設(shè)備，且受人為操作的影響較大，不能適用于現(xiàn)場的快速檢測，難以在基層單位實現(xiàn)大面積的普及和推廣應(yīng)用。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)，是日本科學家 Notomi等[10]創(chuàng)建的一種新型核酸擴增技術(shù)，可針對靶基因設(shè)計能識別相應(yīng)互補位點的4條特異性內(nèi)、外引物，利用Bst DNA聚合酶在60~65℃等溫條件下對其進行延伸，形成啞鈴狀DNA結(jié)構(gòu)，隨后，在此基礎(chǔ)擴增，最終生成DNA片段混合物[10]。結(jié)果主要是通過凝膠電泳法、沉淀法、顯色法等方法進行檢測[11]。SYBR Green I作為一種高靈敏度的DNA熒光染料，安全無毒，結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域[12]，可檢出20pb的DNA，靈敏度高。運用LAMP方法可簡單、快速檢測金黃色葡萄球菌，且靈敏度高，特異型強。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株 金黃色葡萄球菌CICC10477、金黃色葡萄球菌ATCC6538、表皮葡萄球菌CMCC(B)26069、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、鴨沙門氏菌CICC21498、沙門氏菌50001、腸炎沙門氏菌50041、腸炎沙門氏菌CICC21490、大腸埃希氏菌ATCC25922、副溶血性弧菌ATCC17802、福氏志賀ATCC2457T、單增李斯特菌CMCC(B) 54002、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌CMCC(B)52225、阪崎腸桿菌來自軍科院、金黃色葡萄球菌野生菌分離自餃子，粘氏沙雷氏菌、潘氏變形桿菌、奇異變形桿菌、溶血性葡萄球菌、微球菌、屎腸球菌均為野生菌。

1.1.2 儀器與設(shè)備 恒溫水浴鍋(美國WEALTEC CORR公司)、熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher 公司)、生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、4℃離心機、Mini離心機、金屬浴、超凈工作臺等。

1.1.3 試驗試劑 生理鹽水、致病菌相應(yīng)的二次增菌液、腦浸液、無菌拭子、7.5%氯化鈉、肉湯培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、血平板、Bst DNA聚合酶、營養(yǎng)瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂培養(yǎng)基、聯(lián)合增菌液(北京良潤生物科技有限公司)；DNA提取液：含0.5mol/L Tris-HCl、0.05mol/L 乙二胺四乙酸二鈉、0.5%TritonX-100；10×Buffer反應(yīng)緩沖液：含200mmol/L Tris-HCl(pH8.8，25℃)，100mmol/LKCl，100mmol/L(NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1% Triton X-100。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)金黃色葡萄球菌的femA基因的保守區(qū)域，利用生物學在線軟件分析該基因的核苷酸序列，結(jié)合環(huán)介導等溫擴增方法的引物設(shè)計原則，用Primer Explorer V4.0在線引物設(shè)計軟件篩選并合成LAMP引物：內(nèi)引物1、外引物1、內(nèi)引物2、外引物2，見表1。

表1 金黃色葡萄球菌LAMP引物序列

1.2.2 待檢樣品的處理、增菌 按照中華人民共和國國家標準GB 4789.10-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中指定的方法對待檢樣品進行處理及增菌培養(yǎng)。

1.2.3 模板DNA的制備 （1）增菌液模板DNA的制備：取制備的待檢樣品增菌培養(yǎng)液1ml于1.5ml離心管中，10000r/min離心2min，棄上清；滴加100μl DNA提取液，入沸水浴10min；10000r/ min離心2min，上清即為模板DNA。（2）可疑菌落模板DNA的制備：分離挑取單菌落，加入到100μl DNA提取液中，振蕩混勻，沸水浴10min；10000r/min離心2min，上清即為模板DNA。

1.2.4 LAMP檢測方法的建立 金黃色葡萄球菌LAMP反應(yīng)體系見表2。

將配制好的反應(yīng)液上方覆蓋適量滅菌液體石蠟隔絕污染，并做陰性、陽性對照，其中陰性對照為DNA提取液，陽性對照為金黃色葡萄球菌標準菌株DNA提取物。將25μl LAMP反應(yīng)體系配制成反應(yīng)液后，65℃擴增60min。擴增完成后加入1~2μl 1000×SYBR Green I，混勻，肉眼觀察顏色反應(yīng)。在自然光下肉眼觀察顯色情況，在陰性對照呈橙色、陽性對照呈綠色的前提下，待檢樣品呈綠色判為陽性，即檢測樣品中含有金黃色葡萄球菌；待檢樣品呈橙色判為陰性，即檢測樣品中不含有金黃色葡萄球菌。若陰陽性對照與前述情況不符，則檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測。

表2 金黃色葡萄球菌LAMP反應(yīng)體系

1.2.5 特異性試驗 分別對常見的21種食源性致病菌菌株及同源性高的菌株進行檢測，同時設(shè)置金黃色葡萄球菌DNA為陽性對照，DNA提取液為陰性對照，每個樣品重復(fù)2次。

1.2.6 敏感性試驗 取計數(shù)后菌液進行10倍倍比稀釋后，用建立的LAMP檢測方法分別對其進行檢測。

1.2.7 LAMP檢測方法與國標檢測方法的符合性試驗 使用不同濃度的金黃色葡萄球菌處理豬肉、水餃、肉松、巴氏消毒奶、奶粉為樣品，采用所建立的LAMP檢測方法與中華人民共和國國家標準GB 4789.10-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中指定的方法同時進行檢測，比較兩種方法的檢測結(jié)果，每個樣品3次重復(fù)，并設(shè)立陰、陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測方法特異性試驗結(jié)果

對21種常見致病菌的檢測結(jié)果中金黃色葡萄球菌顯示陽性結(jié)果，其余均為陰性，表明本研究建立的金黃色葡萄球菌LAMP檢測方法具有良好的特異性。

2.2 LAMP檢測方法敏感性試驗結(jié)果

對102~105CFU/ml菌落數(shù)的金黃色葡萄球菌LAMP檢測方法敏感性試驗結(jié)果如下表4所示，當金黃色葡萄球菌濃度為102CFU/ml時即可呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。但由于模板提取、稀釋誤差等原因，靈敏度數(shù)量級可能為103CFU/mL，因此，認定該方法對金黃色葡萄球菌菌液檢測的最低檢出濃度為102~103CFU/ml。

表3 特異性試驗結(jié)果

注：“+”代表陽性，“-”代表陰性。

表4 敏感性試驗結(jié)果

注：“+”代表陽性；“-”代表陰性；“-(+/-)”代表陰陽性結(jié)果均會出現(xiàn)，判定陰性。

2.3 與國標檢測方法的符合性試驗結(jié)果

選擇豬肉、水餃、肉松、巴士消毒奶、奶粉為樣品，使用不同濃度的金黃色葡萄球菌對其進行添加，三組重復(fù)試驗結(jié)果如下表5。不同樣品的LAMP方法檢測結(jié)果與國標方法一致，兩者符合率為100%。

表5 金黃色葡萄球菌核酸檢測方法與國標方法檢測結(jié)果

注：“+”代表陽性；“-”代表陰性。

3 討論

（1）LAMP技術(shù)在60~65℃的恒溫條件下反應(yīng)30~60min即可完成基因的擴增，生成由一系列反向重復(fù)的目的基因構(gòu)成的DNA片段環(huán)狀混合物[13]，可有效減少繁瑣的人員操作且無需昂貴的試驗儀器。而選用無毒的SYBR greenI染色代替電泳，避免對操作人員的傷害和對環(huán)境的污染，且實現(xiàn)了樣本DNA產(chǎn)物的可視化檢測；無須DNA模板的熱變性過程，使原本至少90min才能完成的擴增反應(yīng)，縮減到30min，有效節(jié)約檢測時間[14]。（2）本研究將LAMP方法應(yīng)用于食品安全檢測方面，可對食品中金黃色葡萄球菌進行定性定量檢測，最低檢出濃度為102~103CFU/ml，靈敏度和特異性較好。但LAMP方法在應(yīng)用的同時也出現(xiàn)了一些值得注意的方面：一是在引物設(shè)計方面，由于是在線軟件進行設(shè)計，且針對較短靶序列中的6~8個區(qū)域設(shè)計4~6條引物，導致了一些擴增效率較高的其他靶位點容易被忽略[15]，如本研究中選用的是金黃色葡萄菌的femA基因，是在對金黃色葡萄菌nuc基因的前期研究基礎(chǔ)上改良的結(jié)果；二是由于LAMP體系擴增效率極高，且產(chǎn)物穩(wěn)定，不易降解，易發(fā)生攜帶污染，致使假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[16]；三是LAMP體系極易被污染，開管操作應(yīng)在單獨操作室內(nèi)進行，避免被微量污染物污染。當僅用比濁和比色法確定LAMP反應(yīng)結(jié)果時，由于個體對顏色的主觀感知不同，結(jié)果可能會出現(xiàn)偏差[17]。因此，在實際應(yīng)用中，應(yīng)結(jié)合配套讀數(shù)儀器進行定性定量分析。

本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌的femA基因設(shè)計的特異性引物能準確結(jié)合目的基因，建立的金黃色葡萄球菌核酸檢測方法，通過添加SYBR Green I染色實現(xiàn)結(jié)果可視化、快速高效、高靈敏度和高特異性檢測，適用于各層級實驗室和基層單位的普及和推廣。

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（2019–10–15）

S852.61+1

A

1007-1733(2019)12-0007-04