張培培 葉黎青 石承乾 何賢松 葉寶東

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

環(huán)孢素A(cyclosporine,CsA)是強(qiáng)效鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，被廣泛地應(yīng)用于腎、肝、心臟、骨髓等實(shí)體器官移植后抑制免疫排斥反應(yīng)及自身免疫疾病的治療。CsA的臨床應(yīng)用顯著地改善了實(shí)體器官移植的近期存活率[1]，但其腎毒性所引起的慢性環(huán)孢素腎病(chronic cyclosporinenephropathy,CCN)已經(jīng)成為腎移植后功能不全甚至失敗的重要原因[2]。間質(zhì)纖維化是CCN主要的腎臟病理表現(xiàn)。盡管缺乏有效的治療手段，但大量研究提示轉(zhuǎn)化成長因子（transforming growth factor-β1,TGF-β1）是引起慢性腎臟病患者腎間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)[3-4]；同時(shí)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(reninangiotensinsystem,RAS)的激活則會(huì)上調(diào)其核心成分血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)表達(dá)，加劇腎纖維化的進(jìn)展[5]。既往研究報(bào)道，在CCN中，腎內(nèi)RAS的激活會(huì)上調(diào)AngⅡ表達(dá)而促進(jìn)TGF-β1產(chǎn)生，從而加速CCN間質(zhì)纖維化進(jìn)展[6-7]。本研究觀察消瘀泄?jié)犸媽?duì)CCN大鼠Renin、AngⅡ以及TGF-β1表達(dá)的影響，探討消瘀泄?jié)犸媽?duì)CCN防治作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(浙)2013-0184。

1.2 主要試劑和藥品 消瘀泄?jié)犸?(生黃芪30g，制大黃 10g，川牛膝 12g，桃仁 12g，地龍 12g，車前草20g)，所含中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供；洛汀新(鹽酸貝那普利)片（10mg/片）由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H20030514，成人用量10mg·d-1。成人用量按照60公斤體重計(jì)算，大鼠的用藥量根據(jù)人-大鼠的體表面積的轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25而得，即每公斤體重的用藥量為成人的6.25倍，洛汀新大鼠用藥量1mg·kg-1·d-1。各味中藥以單蒸水600mL煎煮1h，共煎2次，2次水煎劑混和后，再以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將各煎劑濃縮。中藥濃縮成消瘀泄?jié)犸嬎幰?0.96g/ml)，4℃裝瓶保存。大鼠用藥量10ml/kg。環(huán)孢素溶液5g/50ml由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H10930130，用橄欖油配置成3mg/ml環(huán)孢素溶液，棕瓶密封，4℃避光保存。大鼠用藥量：25mg·kg-1·d-1。低鹽飼料由開源動(dòng)物飼料（常州）有限公司提供（批號(hào) 16091902），腎素ELISA試劑盒購自美國R&D公司，免疫組化試劑盒購自TaKaRa公司，PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，PCR引物購自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 AU640全自動(dòng)生化分析儀(OLYMPUS，Japan)，顯微鏡（Nikon公司），DK-S12型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），LEICA彩色病理圖像分析系統(tǒng)（LEICA公司，Germany），醫(yī)用微波爐（Galanz公司，中國），STP12脫水機(jī)（MICROM公司），HM335E切片機(jī)（MICROM公司），AP280-2包埋機(jī)（MICROM公司）。

2 方法

2.1 模型制備、分組及用藥方法 雄性SD大鼠全封閉無特定病原體(specific pathogen free，SPF)狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、消瘀泄?jié)犸嫿M、洛汀新組，每組10只。正常組：上午予橄欖油 10ml·kg-1·d-1經(jīng)口灌胃，下午予生理鹽水10ml·kg-1·d-1經(jīng)口灌胃。模型組：造模動(dòng)物上午予CsA30mg·kg-1·d-1經(jīng)口灌胃，下午予生理鹽水10 ml·kg-1·d-1經(jīng)口灌胃。洛汀新治療組：造模動(dòng)物上午予CsA30mg·kg-1·d-1經(jīng)口灌胃，下午予洛汀新溶液10ml·kg-1·d-1。消瘀泄?jié)犸嬛委熃M：造模動(dòng)物上午予CsA30mg·kg-1·d-1經(jīng)口灌胃，下午予中藥10ml·kg-1·d-1。以上藥物灌胃時(shí)間均為4周。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

2.2.1 各組大鼠一般情況和死亡情況 觀察大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、大小便及體重的變化，以及死亡情況。

2.2.2 血肌酐、尿素氮、尿肌酐、24小時(shí)尿總蛋白的檢測(cè) 灌胃完成后分批行麻醉后腹主動(dòng)脈取血，3000r·min-1離心15min后置于-20℃保存待檢，用全自動(dòng)生化分析儀器檢測(cè)血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN）、尿肌酐。大鼠處死前一天時(shí)轉(zhuǎn)移至代謝籠，禁食不禁水，至次日8時(shí)收集尿液，記錄24小時(shí)尿量，并測(cè)定24h尿蛋白(24 hour total urine protein，24hUpro)，計(jì)算肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr）。

2.2.3 腎組織的病理形態(tài)學(xué)改變 取血后處死大鼠，分離左側(cè)腎臟，迅速以10%福爾馬林固定備用，取部分組織切片用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining,HE）常規(guī)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織的病理形態(tài)學(xué)的改變。

2.2.4 腎組織Ⅳ型膠原免疫組織化學(xué)檢查 取10%福爾馬林固定部分組織常規(guī)固定，脫水、石蠟包埋，按二部法進(jìn)行操作，采用德國LEICA彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色陽性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，每張切片光鏡(400×)下隨機(jī)采集5個(gè)不重疊視野,棕黃色為陽性染色區(qū)。測(cè)量棕黃色陽性染色面積，取平均值。并計(jì)算出總光密度=∑Area(陽性表達(dá)部位)面積×Density（該部位的平均光密度），一個(gè)視野的總光密度表示照片內(nèi)所有陽性表達(dá)部位的Area×Density的和。以陽性染色面積和總光密度為參數(shù)進(jìn)行分析。

2.2.5 血清及腎臟組織腎素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法測(cè)定血清及腎臟組織腎素水平：依ELISA說明書操作，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（optical density,OD）值，計(jì)算樣品濃度。

2.2.6 腎組織AngⅡ、TGF-β1mRNA的表達(dá)測(cè)定用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（Real-time Quantitative PCR Detecting System，qPCR）檢測(cè)大鼠腎組織AngⅡ、TGF-β1mRNA的表達(dá)，采用Trizol一步法提取組織總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行qPCR，以β-ACTION為內(nèi)參基因。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA）。組間兩兩比較，方差齊性時(shí)，采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）法；方差不齊時(shí)，采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況和死亡情況的觀察 對(duì)照組大鼠一般狀況良好，活動(dòng)、精神狀況及飲食無明顯異常。模型組大鼠出現(xiàn)拱背現(xiàn)象，急躁易激惹，飲食減少，大便稀溏，毛發(fā)枯黃，精神萎靡，一般情況較差。中藥組及洛丁新組拱背現(xiàn)象、毛發(fā)光澤度、精神、飲食情況較模型組有改善。死亡情況見表2。

表2 各組大鼠死亡情況Tab.2 Deaths in each group of rats

3.2 各組大鼠Scr、BUN、Ccr、24hUpro的結(jié)果 較對(duì)照組，模型組血 Bun、Scr水平明顯升高（P<0.01），Ccr水平顯著降低（P<0.01）；較模型組，消瘀泄?jié)犸嫿M、洛汀新組血Bun、Scr水平明顯降低（P<0.01），Ccr水平顯著升高（P<0.05）；較對(duì)照組，模型組24小時(shí)尿蛋白總量顯著升高（P<0.01）；較模型組，洛汀新組和消瘀泄?jié)犸嫿M24小時(shí)尿蛋白總量均顯著下降（P<0.01），且與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠 Scr、Bun、Ccr、24hUpro(±s)Tab.3 Comparison of Scr,Bun，Ccr and 24h Upro in each group(±s)

表3 各組大鼠 Scr、Bun、Ccr、24hUpro(±s)Tab.3 Comparison of Scr,Bun，Ccr and 24h Upro in each group(±s)

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05Note:Compared with normal control group，**P<0.01；compared with the model group，△△P<0.01,△P<0.05

組別nBun（μmol·L-1）Scr（mmol·L-1）Ccr（ml·Min-1）24hUpro（mg24h-1）對(duì)照組模型組消瘀泄?jié)峤M洛汀新組9 6 9 6 5.92±1.22 62.61±11.84**38.33±8.93△△47.91±13.33△55.82±4.33 190.19±35.12**114.14±40.19△△134.41±57.86△△0.90±0.21 0.18±0.04**0.33±0.05△0.31±0.06△16.06±3.91 29.80±10.16**16.33±7.37△△18.20±8.46△△

3.3 腎組織光鏡檢查結(jié)果 用HE染色法：對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管排列無紊亂，偶有空泡樣變性，偶有炎性細(xì)胞浸潤；模型組腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤，小管上皮細(xì)胞變性、壞死；消瘀泄?jié)犸嫿M炎性細(xì)胞浸潤較模型組減輕，腎小管上皮細(xì)胞變性程度減輕；洛汀新組有炎性細(xì)胞浸潤，小管細(xì)胞有變性壞死，但均較模型組減輕。見圖1。

圖1 各組腎組織光鏡檢查結(jié)果（400×）Fig.1 All groups'kidney tissue changes under light microscopic examination(400×)

3.4 各組大鼠腎組織免疫組化檢查結(jié)果 較對(duì)照組，模型組IV型膠原(collagen-IV,Col-IV)沉積的陽性面積比例、總光密度明顯升高（P＜0.01）。較模型組，消瘀泄?jié)犸嫿M及洛汀新組組織中陽性面積比例、總光密度明顯降低（P＜0.01）。消瘀泄?jié)犸嫿M及洛汀新較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4、圖2。

表4 各組大鼠腎臟組織Col-Ⅳ陽性染色面積和總光密度（±s,×104）Tab.4 The positive staining area and total optical density of Col-Ⅳin the renal tissues of rats in each group（±s,×104）

表4 各組大鼠腎臟組織Col-Ⅳ陽性染色面積和總光密度（±s,×104）Tab.4 The positive staining area and total optical density of Col-Ⅳin the renal tissues of rats in each group（±s,×104）

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01Note:Compared with normal control group,**P<0.01;compared with the model group,△△P<0.01

組別 n 陽性面積 總光密度對(duì)照組模型組消瘀泄?jié)峤M洛汀新組9 6 9 6 0.30±0.54 5.83±5.97**0.33±0.15△△0.93±1.25△△0.10±0.18 2.22±2.55**0.13±0.08△△0.35±0.57△△

圖2 各組大鼠腎組織Col-Ⅳ的表達(dá)（400×）Fig.2 The expression of Col-Ⅳ in the renal tissue of the rats(400×)

3.5 各組大鼠腎組織及血清ELISA檢測(cè)腎素含量結(jié)果 腎組織中：較對(duì)照組，模型組腎素含量顯著上調(diào)（P<0.01）；較模型素組，消瘀泄?jié)犸嫿M及洛汀新組腎素含量下調(diào)，但只有洛汀新組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血清中：較對(duì)照組，模型組腎素含量明顯上升（P<0.01）；較模型組，消瘀泄?jié)犸嫿M及洛汀新組腎素含量明顯下降（P<0.05）。見表5。

表5 各組大鼠腎組織及血清中腎素含量(±s)Tab.5 Renin content in the renal tissues and serum of rats in each group(±s)

表5 各組大鼠腎組織及血清中腎素含量(±s)Tab.5 Renin content in the renal tissues and serum of rats in each group(±s)

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05Note:Compared with normal control group,**P<0.01;compared with the model group,△△P<0.05

組別 n 組織腎素含量(ng·L-1) 血清腎素含量(ng·L-1)對(duì)照組模型組消瘀泄?jié)犸嫿M洛汀新組9 6 9 6 66.38±4.12 80.59±3.45**76.40±3.58 73.75±3.31△420.65±74.03 751±103.67**516.78±106.82△518.34±168.79△

3.6 各組大鼠腎臟組織AngⅡ、TGF-β1mRNA表達(dá)情況 較對(duì)照組，模型組AngIImRNA、TGF-β1mRNA明顯升高（P<0.01）；較模型組，消瘀泄?jié)犸嫿M及洛汀新組AngIImRNA、TGF-β1mRNA 水平明顯降低（P<0.01）；且洛汀新組AngⅡmRNA與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表6。

表6 各組的大鼠腎組織中AngIImRNA、TGF-β1mRNA表達(dá)情況(±s)Tab.6 Expression of AngIImRNA、TGF-β1mRNA in the renal tissues of rats in each group(±s)

表6 各組的大鼠腎組織中AngIImRNA、TGF-β1mRNA表達(dá)情況(±s)Tab.6 Expression of AngIImRNA、TGF-β1mRNA in the renal tissues of rats in each group(±s)

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01Note:Compared with normal control group,**P<0.01;compared with the model group,△△P<0.01

n AngIImRNA 相對(duì)定量(2-△△CT) TGF-β1mRNA 相對(duì)定量(2-△△CT)對(duì)照組模型組消瘀泄?jié)犸嫿M洛汀新組9 6 9 6 1.08±0.40 7.72±1.36**3.66±2.06△△1.21±0.51△△1.01±0.14 3.38±0.59**2.10±0.38△△2.41±0.43△△#

4 討論

20世紀(jì)80年代以后，CsA廣泛運(yùn)用于器官移植、骨髓移植及免疫性疾病，但其腎毒性是在CsA治療過程中最常見的副作用之一，其機(jī)制與RAS的激活、交感神經(jīng)興奮、內(nèi)皮素生成、氧化應(yīng)激等相關(guān)[8]，共同加速CCN的進(jìn)展。CsA通過激活RAS增加腎間質(zhì)纖維化相關(guān)因子TGF-β1表達(dá)是其影響CCN發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[6-8]。CCN是導(dǎo)致慢性移植腎病的非免疫因素之一,減低或停用CsA并不能改善腎功能，是影響患者在器官移植術(shù)后長期存活的一個(gè)重要因素。因此發(fā)現(xiàn)CCN并及時(shí)對(duì)CCN患者進(jìn)行干預(yù)，對(duì)患者改善預(yù)后、提高生活質(zhì)量具有重要意義。

腎間質(zhì)纖維化是包括CCN等各種慢性腎臟病發(fā)展到終末期階段的共同病理表現(xiàn)，TGF-β1在腎纖維化疾病中被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的促纖維化介質(zhì)。目前已經(jīng)確定的有TGF-β三種亞型，TGF-β1為最常見的亞型，在所有類型的腎臟常駐細(xì)胞均可產(chǎn)生[3-4]。TGF-β1結(jié)合 TGF-βⅡ型受體(TypeⅡ TGF-βreceptor,TβRⅡ)后，激活 TGF-β1型受體(Type I TGF-β receptor,TβRI)傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，通過磷酸化Smad2、Smad3并與共同性Smad4形成一個(gè)低聚物，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，引起以Col-IV為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc,ECM）沉積，發(fā)揮促纖維化作用[4]；而Smad7則競(jìng)爭性地與活化受體結(jié)合，發(fā)揮其對(duì)TGF-β/Smad通路負(fù)性調(diào)控作用。研究表明CCN大鼠腎組織TGF-β1、Smad2/3及Smad4表達(dá)增加，而通過瑞舒伐他汀治療可下調(diào)上述因子的表達(dá)，并延緩CsA引起的腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化[9]。RAS是機(jī)體重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，具有維持電解質(zhì)、體液的平衡，血壓的穩(wěn)定等作用。而在CCN中，過表達(dá)的腎素促進(jìn)血管緊張素I的生成，從而上調(diào)RAS最主要的活性肽AngⅡ表達(dá)，引起高血壓，刺激炎性或成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)ECM生成及在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積，還可介導(dǎo)腎臟氧化應(yīng)激，導(dǎo)致CCN的進(jìn)展[5,10]。Yoon等[11]研究發(fā)現(xiàn)氯沙坦降低CCN氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)Klotho基因表達(dá)，達(dá)到保護(hù)腎臟作用。Kim等[12]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氯沙坦可通過下調(diào)骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、TGF-β1的表達(dá)來減輕由CCN引起的腎小管損傷、間質(zhì)纖維化及小動(dòng)脈病，證實(shí)通過降低或阻斷AngII作用可抑制TGF-β/Smad通路而延緩CCN進(jìn)展。

消瘀泄?jié)犸嬘裳a(bǔ)陽還五湯加減化裁而來，由黃芪、川牛膝、桃仁、地龍、制軍、車前草組成，筆者在臨床上廣泛應(yīng)用于慢性腎衰竭氣虛夾瘀濁的病證[13]，能夠明顯改善慢性腎功能衰竭患者的臨床癥狀，降低BUN及Scr水平，提高Ccr[14]，并能改善UUO模型大鼠BUN、Scr水平，其機(jī)制跟下調(diào)TGF-β1表達(dá)延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展有關(guān)[15-16]。本研究建立CCN大鼠模型，進(jìn)一步探討消瘀泄?jié)犸嬆芊裢ㄟ^調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)起到延緩CCN纖維化進(jìn)展。CCN大鼠模型的建立已較為成熟。國外有學(xué)者在低鹽飲食狀態(tài)下，成功地制造了CCN大鼠的模型，方法是采用大鼠皮下注射CsA4周[17]。國內(nèi)學(xué)者喬保平等在低鹽條件下，用予灌胃大鼠環(huán)孢素的辦法，造成腎損害模型，摸索了造模環(huán)孢素的劑量，以 30mg·kg-1·d-1最顯著[18]。學(xué)者譚州科等使用環(huán)孢素 25mg·kg-1·d-1，4周時(shí)造成了典型的環(huán)孢素腎病模型[19]。在前期研究中，課題組使用環(huán)孢素 30mg·kg-1·d-1，大鼠存活率低，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，采取低鹽飲食下，以環(huán)孢素口服液25mg·kg-1·d-1灌胃4周的造模方法。采用這種方法，模型組腎組織顯示腎小管上皮細(xì)胞大量變性壞死，間質(zhì)中有大量炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化明顯，表明造模成功。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較模型組，消瘀泄?jié)犸嫾奥逋⌒履苊黠@改善CCN大鼠Bun、Scr及Ccr，減少24小時(shí)尿蛋白，降低血清及腎組織腎素水平，下調(diào)腎組織AngⅡ、TGF-β1mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，消瘀泄?jié)犸嫿M腎組織Col-Ⅳ表達(dá)明顯降低，腎臟組織病理纖維化程度明顯改善，表明下調(diào)RAS系統(tǒng)相關(guān)成分的表達(dá)進(jìn)而抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路可能是消瘀泄?jié)犸嬔泳廋CN進(jìn)展的機(jī)制之一。研究結(jié)果還顯示，消瘀泄?jié)犸嫿M大鼠死亡率明顯低于洛汀新組和模型組，說明中藥消瘀泄?jié)犸嬆軠p輕環(huán)孢素的整體毒性作用，值得進(jìn)一步研究。