武曉靈 喻莉 龍鼎 楊軍輝

華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（武漢430014）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是重癥醫(yī)學(xué)科常見(jiàn)的臨床綜合征，可由肺內(nèi)及肺外多種原因?qū)е?，其中膿毒癥是ARDS 最主要的原因，膿毒癥所致的ARDS 患者病情更加嚴(yán)重，病死率也更高［1-4］。研究表明炎癥反應(yīng)在ARDS 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。因此，如何抑制ARDS 的炎癥反應(yīng)，從而減輕ARDS 的肺損傷成為研究的熱點(diǎn)。鹽酸小檗堿（berberine，BBR），又稱黃連素，是從黃連、黃柏、三顆針等植物中提取的生物堿，在臨床上常作為廣譜抗生素使用，最開(kāi)始主要用于胃腸道疾病的抗菌治療［5-7］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BBR 在治療糖尿病、心血管疾病、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、精神疾病等方面具有廣泛的藥理作用［8-11］。本研究探討B(tài)BR 對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的ARDS 小鼠肺損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為ARDS的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備54 只雄性野生型C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組（n＝18）、LPS 組（n＝18）和LPS+BBR（n＝18）。對(duì)照組氣道內(nèi)滴入50 μL PBS 溶液；LPS 組氣道內(nèi)滴入LPS（2 mg/kg）溶液50 μL；LPS+BBR 組小鼠，先用50 mg/kg 的BBR 灌胃預(yù)處理，2 h 后氣道內(nèi)滴入LPS 溶液50 μL。LPS 滴入8 h 后處死所有小鼠，并進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 試劑和儀器內(nèi)毒素（美國(guó)Sigma 公司）；鹽酸小檗堿（BBR，Sigma，PHR1502）；小鼠的TNF-α、IL-6、IL-10 的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（美國(guó)R&D 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，23227）。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 病理學(xué)檢測(cè)處死小鼠，分離左肺，將其固定于10%中性福爾馬林固定液中，制作肺組織石蠟切片并進(jìn)行伊紅-蘇木素染色（HE 染色）。

1.3.2 肺組織濕/干重比值處死小鼠后分離雙肺，漂洗，無(wú)菌濾紙擦干后立即天平上稱重，記為肺臟的濕重；然后把雙肺組織放在烘箱內(nèi)烘烤一周后再次稱量，記為肺臟的干重，計(jì)算肺臟的濕/干重比值。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥因子處死小鼠，游離氣管，用縫合線將22G 注射針頭和氣管結(jié)扎固定。0.9%氯化鈉溶液0.8 mL 緩慢推入氣管內(nèi)，反復(fù)抽吸3 次后回抽液體，靜置后1 000 r/min 離心10 min，收集上清，分裝后-80 ℃保存。按試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定炎癥因子TNF-α、IL-6 和抗炎因子IL-10 水平。

1.3.4 小鼠血漿中炎癥因子成功麻醉小鼠后，在心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處穿刺緩慢抽取約0.8～1 mL 血液，靜置后3 000 r/min 離心5 min，收集上層血漿，分裝，置于-80 ℃冰箱。按試劑盒說(shuō)明書分別測(cè)定炎癥因子TNF-α、IL-6 和抗炎因子IL-10 水平。

肺組織中炎癥因子等基因mRNA 含量：提取肺組織的總RNA，用紫外檢測(cè)儀在波長(zhǎng)分別為260 nm 和280 nm 時(shí)讀取每組RNA 的光吸收值，從而計(jì)算各炎癥因子RNA 的濃度和純度。

1.3.5 肺組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平提取肺組織的總蛋白，按說(shuō)明書進(jìn)行蛋白定量（BCA Protein Assay Kit 定量），蛋白變性，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育，成像儀上顯影成像，運(yùn)用Qμantity One 軟件分析計(jì)算蛋白條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺部病理學(xué)改變HE 染色可看出對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整（圖1A），無(wú)炎癥滲出。而LPS組小鼠肺組織有斷裂或破損，伴有微血管內(nèi)微血栓形成及充血和出血，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增厚（圖1B）。而LPS+BBR 組小鼠肺組織損傷較LPS 組明顯減輕，微血管內(nèi)僅少量充血和出血，肺泡腔和肺間質(zhì)僅少量炎性滲出，肺泡間隔也明顯變?。▓D1C）。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，小鼠的肺組織損傷評(píng)分：LPS 組大于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖2）。小鼠肺組織濕/干重比值：LPS 組大于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖3）。

2.2 炎癥因子水平的比較炎癥因子TNF-α、IL-6水平在支氣管-肺泡灌洗液中：LPS 組明顯大于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖4）；血漿中：LPS 組明顯大于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖5）；而抗炎因子IL-10 水平在支氣管-肺泡灌洗液中：LPS 組小于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖4）；血漿中：LPS 組小于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖5）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS 組炎癥因子TNF-α、IL-6 的mRNA 含量明顯高于LPS+BBR 組及對(duì)照組；而抗炎因子IL-10 的mRNA 含量明顯低于LPS+BBR 組及對(duì)照組（P＜0.05，圖6）。

圖1 3 組小鼠肺組織病理學(xué)比較（200×）Fig.1 HE staining results of lung tissue of three groups of mice（200×）

圖2 3 組小鼠肺組織損傷評(píng)分比較Fig.2 Comparison of lung tissue injury scores in three groups of mice

圖3 3 組小鼠肺臟濕/干重比值比較Fig.3 Comparison of lung wet/dry weight ratios of the three groups of mice

2.3 對(duì)NF-κB 信號(hào)通路的異常激活影響LPS 組小鼠肺臟組織中p65 水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05，圖7），而LPS+BBR 組小鼠肺臟組織中p65 水平較LPS 組則顯著降低（P＜0.05，圖7）。

3 討論

圖4 3 組小鼠支氣管肺泡灌洗液中各炎癥因子水平比較Fig.4 Comparison of the levels of inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid of three groups of mice.ns There was no statistically significant difference

圖5 3 組小鼠血漿中各炎癥因子水平比較Fig.5 Comparison of the levels of inflammatory factors in plasma of three groups of mice

ARDS 的病理特征是肺毛細(xì)血管通透性增高，其基礎(chǔ)是多種炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，導(dǎo)致肺局部炎癥反應(yīng)失控，肺泡內(nèi)釋放大量細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)。臨床表現(xiàn)為頑固性的低氧血癥，嚴(yán)重甚至導(dǎo)致多器官功能障礙［12-16］。目前普遍認(rèn)為失控的炎癥反應(yīng)與ARDS 的病理生理密切相關(guān)，炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α 等的釋放激活中性粒細(xì)胞分泌超氧化物等活化因子，進(jìn)一步加重肺泡及血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［17-19］。本研究成功運(yùn)用LPS建立ARDS 小鼠模型，LPS 處理的小鼠有明顯的肺水腫和炎癥浸潤(rùn)，肺組織損傷評(píng)分和肺濕/干重比值均明顯升高，支氣管肺泡灌洗液及血漿中炎癥因子水平均較對(duì)照組明顯升高。

圖6 3 組小鼠肺組織中各炎癥因子的mRNA 相對(duì)含量Fig.6 The relative content of mRNA of inflammatory factors in lung tissue of three groups of mice

圖7 3 組小鼠的肺組織中p-P65、p65 的蛋白表達(dá)水平Fig.7 The protein expression levels of p-P65 and p65 in the lung tissues of the three groups of mice

小檗堿是黃連的主要生物堿成分，其影響各種生物功能，如細(xì)胞增殖，遷移和存活，具有抗菌活性、抗炎作用、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用［20-21］。研究發(fā)現(xiàn)，BBR 可抑制急性肝衰竭中NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位，從而抑制炎癥細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)。還可以通過(guò)在體外和體內(nèi)減少細(xì)胞色素c 釋放，Bax/ Bcl-2 比率和胱天蛋白酶-3/-9 切割有效地抑制急性肝衰竭的細(xì)胞凋亡［22］。BBR 可以抑制海馬中IBA1，IL-1β 和IL-6 的釋放，從而減輕老年人術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD）［23］。還可以通過(guò)腫瘤壞死因子（TNF）受體相關(guān)因子5（TRAF5）介導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活對(duì)CRF 發(fā)揮保護(hù)作用［24］。MO 等［25］及KIM 等［26］研究發(fā)現(xiàn)BBR 可能通過(guò)激活A(yù)MP 活化蛋白激酶（AMPK）、上調(diào)SIRT1 減輕機(jī)械通氣造成的肺水腫、抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、降低炎癥介質(zhì)的表達(dá)和釋放。本研究結(jié)果也顯示，BBR 預(yù)處理后膿毒癥ARDS 小鼠肺組織炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，炎癥因子TNF-α、IL-6 的水平明顯降低，抗炎因子IL-10 的表達(dá)水平明顯升高，從而證實(shí)BBR 對(duì)膿毒癥ARDS的肺組織具有保護(hù)作用。既往研究表明NF-κB 與ARDS 炎癥反應(yīng)調(diào)控失衡有關(guān)，抑制NF-κB 的活性可以減輕ARDS 的肺損傷程度。本研究結(jié)果顯示BBR 可以抑制NF-κBp-P65 的水平，因此筆者推測(cè)BBR 可能通過(guò)抑制ARDS 的NF-κB p-P65 發(fā)揮肺保護(hù)作用。

綜上，BBR 的預(yù)防性干預(yù)可以減輕膿毒癥ARDS 小鼠肺組織炎癥反應(yīng)，抑制炎癥因子TNF-α、IL-6 的水平，從而改善肺組織炎癥損傷，其可能是通過(guò)抑制NF-κBp-P65 發(fā)揮抗炎作用。