陳剛 史少明 邢雅軍 李雙根 魏晨晨

南京鼓樓醫(yī)院高淳分院（南京市高淳人民醫(yī)院）1呼吸內(nèi)科，2腫瘤內(nèi)科（南京211300）；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科（南京210000）

根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)，非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）占所有男性癌癥死亡人數(shù)的26%，和女性癌癥死亡人數(shù)的25%［1］。盡管NSCLC 在手術(shù)、放射治療和抗癌藥物方面進(jìn)展迅速，但NSCLC 患者的5年生存率仍然很低，僅為16.6%［2-3］。因此，迫切需要利用潛在的機(jī)制來(lái)鑒定腫瘤發(fā)展過(guò)程中異常表達(dá)的基因，并借此建立具有高敏感性和特異性的新型生物標(biāo)志物，以促進(jìn)NSCLC 的早期診斷和治療。

根據(jù)ENCODE 聯(lián)盟的研究，人類70%的基因組被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA 分子。非編碼RNA 之前一直被當(dāng)做轉(zhuǎn)錄“垃圾”，但現(xiàn)有的研究逐漸發(fā)現(xiàn)lncRNA 的細(xì)胞功能包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化或癌癥進(jìn)展和入侵，它們參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展［4］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 在NSCLC患者中存在異常表達(dá)，可通過(guò)表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后翻譯等多種途徑參與NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程［5］。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNAs可以在血清中穩(wěn)定的表達(dá)，并能夠?qū)SCLC 進(jìn)行早期診斷［6］。由于傳統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物對(duì)早期NSCLC 的敏感性和特異性有限，如癌胚抗原（CEA）、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和細(xì)胞角蛋白199（CA199），篩選其他替代分子作為NSCLC 的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物變得至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA PVT1［7］、DANCR［8］、ZEB1-AS1［9］、SNHG5［10］和HOTTIP［11］在NSCLC 組織中異常表達(dá)，并與肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和化療藥物耐藥有關(guān)。但是，截止目前，并未有研究檢測(cè)上述這些lncRNA 在NSCLC 患者血清中的表達(dá)水平。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC 患者血清lncRNA 表達(dá)，與健康者和肺良性結(jié)節(jié)患者血清lncRNA 表達(dá)水平進(jìn)行比較，篩選出異常表達(dá)的lncRNA。有研究結(jié)果顯示只有血清SNHG5 表達(dá)水平在NSCLC中下調(diào)。因此，本研究進(jìn)一步探討血清SNHG5 與NSCLC 患者病情的相關(guān)性，及其在NSCLC 患者中的臨床診斷價(jià)值，為NSCLC 的早期診斷提供新型潛在性的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料血清和組織RNA 提取試劑TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Master Mix）、RT-qPCR 試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ）購(gòu)自日本TaKaRa 公司；lncRNA 和內(nèi)參基因由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象收集2017年9月至2018年9月在我院就診的NSCLC 患者60例，男45例，女15例，年齡38～79 歲，平均（52.45 ± 4.39）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理組織學(xué)確診為NSCLC；（2）入組前未接受肺癌相關(guān)的手術(shù)、化放療或生物學(xué)治療；（3）根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)［12］，研究對(duì)象包括Ⅰ期15例，Ⅱ期26例，Ⅲ期19例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他惡性腫瘤；（2）患者臨床資料不完整；（3）既往接受過(guò)其他抗癌治療；（4）入組前半年內(nèi)接受過(guò)手術(shù)治療。此外，納入同期在本院健康體檢人群60例為健康對(duì)照組，男44例，女16例，年齡35～75 歲，平均（52.45 ± 4.39）歲。并納入同期經(jīng)手術(shù)治療確診為肺良性結(jié)節(jié)（最大直徑≤3.0 cm）的38例患者，男22例，女16例，年齡37～70 歲，平均（53.61±6.53）歲。收集并記錄NSCLC 患者吸煙史、腫瘤大小和TNM 分期等數(shù)據(jù)。所有研究對(duì)象均簽訂知情同意書。經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批同意。

1.2.2 樣本采集抽取所有研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL 于促凝管中，室溫垂直靜置半小時(shí)后，常溫下1 500 r/min 離心10 min，吸取上層液體至標(biāo)記好的EP 管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，留取NSCLC 患者術(shù)后1 d、1 周及1、2、4 和6 個(gè)月的血標(biāo)本，按照上述方法準(zhǔn)備血清樣本。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)組織或血清lncRNA 表達(dá)用TRIzol 提取各組織或血清的總RNA，通過(guò)NanoDrop ND1000 分光光度計(jì)（Thermofisher 公司）確定RNA 純度和濃度。隨后，對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。采用RTqPCR 檢測(cè)血清SNHG5 和內(nèi)參基因GAPDH 的表達(dá)，反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC 水6 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：第一階段：95 ℃5 min），第二階段：95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)，每組樣品重復(fù)3 次。基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。GAPDH 正向引物：5′- CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′。反向引物：5′- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′；PVT1 正向引物：5′- CTAATTATTCGGTAACTGACTTGA-3′。反向引物：5′- ACAGTTCAGCCAATCACTTGGA-3′；DANCR 正向引物：5′-CTGCATTCCTGAACCGTTATCT-3′。反向引物：5′-GGGTGTAATCCACGTTTCTCAT-3′；ZEB1-AS1 正向引物：5′-TTGGCACATACAGCCATC-3′。反向引物：5′-TACCCTGCACAAACCCGAAA-3′；SNHG5 正向引物：5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′。反向引物：5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′；HOTTIP 正向引物：5′-CACACTCACATTCGCACACT-3′。反向引物：5′-TCCAGAACTAAGCCAGCCATA-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示。兩組間比較分析使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)；受試者工作曲線（ROC）用于評(píng)估SNHG5 對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值，并計(jì)算ROC 曲線下面積（AUC）及95%置信區(qū)間（95%CI），并計(jì)算相應(yīng)的敏感性和特異性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG5在NSCLC組織和血清的表達(dá)水平本研究檢測(cè)既往報(bào)道在NSCLC 組織中異常表達(dá)的5種lncRNA 在NSCLC 患者和健康體檢者血清中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：健康體檢者、肺良性結(jié)節(jié)和NSCLC 血清中SNHG5 的表達(dá)水平分別為（2.03 ±0.63）、（1.94 ± 0.53）和（1.61 ± 0.57），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 8.48，P＜0.01）；兩兩多重比較結(jié)果顯示，NSCLC 血清中SNHG5 表達(dá)低于健康體檢者（t= 5.69，P＜0.01）和良性結(jié)節(jié)患者（t= 3.46，P= 0.01）；而3 組對(duì)象血清PVT1、DANCR、ZEB1-AS1 和HOTTIP 表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC、肺良性結(jié)節(jié)患者和健康體檢者血清5 種lncRNA 表達(dá)水平Tab.1 Levels of 5 serum lncRNAs in patients with NSCLC，benign pulmonary nodules and healthy subjects ±s

表1 NSCLC、肺良性結(jié)節(jié)患者和健康體檢者血清5 種lncRNA 表達(dá)水平Tab.1 Levels of 5 serum lncRNAs in patients with NSCLC，benign pulmonary nodules and healthy subjects ±s

分組健康對(duì)照組良性結(jié)節(jié)組NSCLC 組F 值P 值例數(shù)60 38 60 PVT1 0.79±0.14 0.86±0.17 0.82±0.11 1.74 0.18 DANCR 0.32±0.10 0.30±0.13 0.35±0.09 2.85 0.07 ZEB1-AS1 1.39±0.83 1.27±0.95 1.48±0.75 0.74 0.48 SNHG5 2.03±0.63 1.94±0.53 1.61±0.57*8.48＜0.01 HOTTIP 0.04±0.02 0.03±0.03 0.05±0.02 2.59 0.06

2.2 血清SNHG5 與NSCLC 患者臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)一步分析血清SNHG5 在NSCLC 中的臨床意義， 將NSCLC 患者按照血清SNHG5 的中位數(shù)為1.68，分成SNHG5 低表達(dá)組和SNHG5 高表達(dá)組，每組30例，并分析比較兩組患者的臨床病理特征見(jiàn)表2。SNHG5 低表達(dá)與腫瘤大小和有相關(guān)性（P= 0.036），但與性別、年齡、吸煙和臨床TNM 分期無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。隨后，進(jìn)一步比較不同分期的NSCLC 患者血清SNHG5 的表達(dá)情況（圖1），發(fā)現(xiàn)Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期的NSCLC 患者血清SNHG5 表達(dá)為（1.20 ± 0.59）、（1.70 ± 0.47）和（1.80 ± 0.54）。與肺良性結(jié)節(jié)患者比較，Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。根據(jù)上述結(jié)果，筆者推測(cè)SNHG5 的下調(diào)可能與NSCLC 的病情有關(guān)，尤其是NSCLC 早期。

2.3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與NSCLC 臨床常用指標(biāo)的相關(guān)性為了進(jìn)一步探討血清SNHG5 水平與臨床NSCLC 傳統(tǒng)指標(biāo)（包括CEA、NSE、CA125 和CA199 等）的相關(guān)性，60例NSCLC 患者根據(jù)本院規(guī)定的正常參考值被分為2 組（表3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清SNHG5 水平與NSE、CA125 無(wú)關(guān)，而與CAE和CA199有關(guān)（P＜0.05）。

2.4 手術(shù)對(duì)NSCLC 患者血清SNHG5 水平的影響鑒于血清SNHG5 水平與臨床NSCLC 嚴(yán)重程度的相關(guān)性，筆者進(jìn)一步分析手術(shù)對(duì)血清SNHG5水平的影響。結(jié)果顯示：術(shù)后1 d 血清SNHG5 水平較術(shù)前輕度下降（P =0.005）；術(shù)后1 周血清SNHG5 水平較術(shù)前相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.538）。術(shù)后個(gè)1～6 個(gè)月，血清SNHG5 水平較術(shù)前均明顯增加，1、2、6 個(gè)月的水平分別為（1.91 ±0.73）、（2.03 ± 0.54）和（2.13 ± 0.64）（與術(shù)前比較P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

表2 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與臨床病理特征的相關(guān)性Tab.2 Correlation between serum SNHG5 levels and clinicopathological features in patients with NSCLC例

圖1 肺良性結(jié)節(jié)患者和不同分期的NSCLC 患者血清SNHG5 的水平比較Fig.1 Comparison of serum SNHG5 levels in patients with benign pulmonary nodules and NSCLC patients with different stages

表3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與血清指標(biāo)的比較Tab.3 Comparison of serum SNHG5 levels and serum indicators in patients with NSCLC ±s

表3 NSCLC 患者血清SNHG5 水平與血清指標(biāo)的比較Tab.3 Comparison of serum SNHG5 levels and serum indicators in patients with NSCLC ±s

變量CEA（μg/L）≤5.0＞5.0 NSE（ng/mL）≤18.3＞18.3 CA125（U/mL）≤35＞35 CA199（U/mL）≤37＞37例數(shù)42 18 49 11 47 13 46 14血清SNHG5 水平1.84±0.52 1.31±0.37 1.79±0.67 1.42±0.53 1.55±0.55 1.49±0.36 1.96±0.48 1.22±0.32 t 值3.712 1.711 0.370 5.398 P 值0.002 0.093 0.712＜0.001

圖2 NSCLC 患者術(shù)前和術(shù)后血清SNHG5 的水平（n=60）Fig.2 Serum SNHG5 levels in preoperative and postoperative NSCLC patients

2.5 SNHG5 對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值基于上述結(jié)果，ROC 曲線方法被用于分析血清SNHG5 對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值分析，見(jiàn)表4、圖3。在本研究中，CEA 用 于 診 斷NSCLC 的AUC 值 為0.667（0.575～0.750），敏感性和特異性為61.67%和78.33%；CA199 用于診斷NSCLC 的AUC 值與CEA類似，為0.667（0.575～0.750）；而SNHG5 用于診斷NSCLC 的AUC 值為0.735（0.647～0.812），敏感性和特異性為68.33%和76.67%，較CEA 和CA199 提高。同時(shí)，CEA 或CA199 聯(lián)合SNHG5 均可以提高診斷NSCLC 的價(jià)值。并且，三者聯(lián)合診斷NSCLC的價(jià)值可提高至0. 796（0.713～0.864），敏感性和特異性為65.00%和83.33%。

表4 ROC 分析不同血清指標(biāo)對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值Tab.4 ROC analysis of the diagnostic value of different serum indicators for NSCLC

圖3 SNHG5 聯(lián)合CEA 和CA199 在預(yù)測(cè)NSCLC 中的ROC曲線分析比較Fig.3 Comparison of ROC Curves in SNHG5 Combined with CEA and CA199 when Predicting NSCLC

3 討論

眾所周知，早期診斷是提高肺癌患者生存率的主要途徑，但目前仍難以實(shí)現(xiàn)。包括CEA、NSE和CA125 等在內(nèi)的單一血清學(xué)指標(biāo)對(duì)肺癌的診斷敏感性和特異性通常不能令人滿意，特別是對(duì)于早期臨床分期［13］。

lncRNA 是一組長(zhǎng)度超過(guò)200 nt 而沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA 分子，最近成為全球研究的焦點(diǎn)［14］。越來(lái)越多的研究表明，lncRNAs 在癌癥如乳腺癌、宮頸癌和肺癌中發(fā)揮著重要作用［15］。由于可能檢測(cè)到癌癥患者的血漿或甚至尿液中的lncRNA，它們可以用作早期診斷癌癥的生物標(biāo)志物。例如，LI 等［16］發(fā)現(xiàn)126例NSCLC 患者血清lncRNA AFAP1-AS1 表達(dá)小副增加，其與肺癌病灶大小、病例分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)；同時(shí)AFAP1-AS1 診斷NSCLC 的AUC 值為0.759（0.692～0.826）。而譚楠等［17］的研究結(jié)果表明，NSCLC 患者血清中H19 的表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TMN 分期有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)均表明lncRNA 可以作為肺癌診斷和預(yù)后的分子生物標(biāo)志物。

本研究通過(guò)查詢有關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)PVT1、DANCR、ZEB1-AS1、SNHG5 和HOTTIP 等5 種lncRNA均被報(bào)道證實(shí)在NSCLC 組織或細(xì)胞中異常表達(dá)且參與NSCLC 的生物學(xué)活性。但是截止目前，并未有研究檢測(cè)這5 種lncRNA 在NSCLC 患者血清的表達(dá)情況。通過(guò)RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)上述lncRNA 中只有血清SNHG5 的水平在NSCLC 患者和對(duì)照組（包括良性肺結(jié)節(jié)和健康體檢者）中有差異。SNHG5 是5'TOP 家族的一員，其可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲［18］。在NSCLC 中，SNHG5 表達(dá)下降，且過(guò)表達(dá)SNHG5 可增加NSCLC 細(xì)胞對(duì)易瑞沙的敏感性［10］。本研究首次檢測(cè)NSCLC 患者血清SNHG5 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與NSCLC 組織表達(dá)類似，血清SNHG5 表達(dá)也顯著下降。目前對(duì)于血清SNHG5 的研究較少。只有ICHIGOZAKI 等［19］發(fā)現(xiàn)在惡性黑色素瘤患者的血清中表達(dá)下降，但其并未進(jìn)一步探討其臨床意義。本研究首次探討血清SNHG5 在NSCLC 患者中異常表達(dá)。血清中SNHG5 的表達(dá)水平與患者年齡、性別及吸煙無(wú)相關(guān)性，但與病灶大小有關(guān)，提示其可能參與NSCLC 的增殖但仍需要?jiǎng)游镌隗w和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明SNHG5 參與NSCLC 的增殖。此外，雖然Ⅱ期和Ⅲ期患者血清SNHG5 水平與健康體檢者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 水平顯著低于肺良性結(jié)節(jié)患者，提示SNHG5 具有早期診斷NSCLC 的價(jià)值。但是，本研究納入的病例缺乏Ⅳ期患者，故仍需要擴(kuò)大樣本，進(jìn)一步分析血清SNHG5 在NSCLC 中的臨床意義。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后患者血清SNHG5 水平與術(shù)前比較，具有顯著增加的趨勢(shì)，提示SNHG5 在評(píng)估NSCLC 術(shù)后病情方面也有潛在價(jià)值。但需要納入術(shù)后復(fù)發(fā)患者來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)。

此外，本研究進(jìn)一步比較了SNHG5 與傳統(tǒng)診斷NSCLC 的血清學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)SNHG5 與CEA 和CA199 相關(guān)，進(jìn)一步比較了以上3 者診斷NSCLC 的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG5 診斷NSCLC 的價(jià)值均高于CEA 或CA199。鑒于目前多指標(biāo)聯(lián)合診斷可顯著提高診斷價(jià)值［20］，筆者分別聯(lián)合了2 項(xiàng)或3 項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合三項(xiàng)指標(biāo)診斷NSCLC 的AUC 值達(dá)0.796，顯著高于單項(xiàng)或2 項(xiàng)指標(biāo)的AUC 值，且具有較高的特異性（83.33%），表明聯(lián)合檢測(cè)血漿SNHG5、CEA 和CA199 早期診斷NSCLC 具有可行性，可考慮在臨床使用。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)SNHG5 在NSCLC患者血清中表達(dá)下降，并且SNHG5 表達(dá)水平與NSCLC 患者腫瘤大小相關(guān)；Ⅰ期NSCLC 患者血清SNHG5 較健康者下降。此外，SNHG5 表達(dá)水平與CEA 和CA199 相關(guān)；血清SNHG5 可用于早期診斷NSCLC，且在評(píng)估NSCLC 術(shù)后病情方面也有潛在價(jià)值。