鄒宇聰 劉剛 高彥平 殷海東 毛箏

南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院1康復醫(yī)學科，2中醫(yī)骨傷科（廣州510630）；3南方醫(yī)科大學順德醫(yī)院骨科（廣州528300）

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）隸屬中醫(yī)痹證范疇，是一種慢性炎癥性疾病，易引起關節(jié)強直，功能活動喪失［1］。AS 前期和中期主要包括炎癥反應和病理成骨兩個階段，但在AS 病理進展后期存在著一個矛盾現(xiàn)象，即AS 附著點發(fā)生病理性骨化，出現(xiàn)“骨痹”，但松質骨（如椎體）卻存在骨質疏松，表現(xiàn)“骨痿”征象［2］。研究［3］顯示在AS患者中骨質疏松的檢出率超過50%，而10年內(nèi)椎體和股骨頸發(fā)生骨密度降低的概率分別為54%和51%［4］。一項回顧性研究［5］顯示，與健康人群相比，AS 患者更容易發(fā)生骨折，而且骨折發(fā)生率隨著患病時間增長而升高，在疾病診斷后20～30年，骨折發(fā)生率達到最高為17%。

雷公藤多苷（tripterygium glycosides，TG）和淫羊藿苷（icarrin，Ica）分別是中醫(yī)臨床中常用通痹方和補腎方中的代表成分，本研究在筆者前期單純應用雷公藤多苷的基礎上進一步聯(lián)合應用淫羊藿苷治療AS，探討聯(lián)合應用TG 和Ica“補腎除痹法”是否可以同時抑制AS 的病理性骨化和骨質疏松。

1 材料與方法

1.1 蛋白多糖（PG）的提取和AS 造模蛋白多糖購自Sigma，雌性Balb/c 小鼠60 只購自北京維通利華公司，SPF 級別動物房飼養(yǎng)，在第0、3、6 周應用提取好的上述100 μg 軟骨蛋白聚糖腹腔注射，首次和末次PG 注射時加入完全弗氏佐劑（Difco，Detroit，MI，美國），第2 次注射時加入不完全弗氏佐劑（Difco）。5 只不進行造模作為空白對照組，造模過程中密切檢測小鼠的生命活動情況。55 只小鼠造模過程中，有4 只在造模過程中因免疫反應死亡，2 只在影像學檢查中因麻醉過量死亡，36 只小鼠經(jīng)確定造模成功，造模成功率為73%（接近文獻75%的成功率）。在第16 周時將36 只造模成功的實驗小鼠分為單純TG 組（n＝12）、TG 聯(lián)合Ica組（n＝12）和0.9%生理鹽水組（陰性對照組）進行灌胃（n＝12）。前述空白對照組不進行任何干預（n＝5），觀察期間密切注意小鼠生命體征，采用小動物MRI 觀察造模情況。

1.2 TG 溶液配制和Ica 灌胃TG 溶液的配制：雷公藤多苷片（安徽新隴海，國藥準字號Z34021048）研磨成細粉，將TG 藥粉用0.5%CMC-Na 液配制成每0.5 mL 含生藥0.9 mg 的混懸溶液，按9.1 mg/kg灌胃，每日1 次。Ica（上海友思生物技術有限公司，規(guī)格：20 mg/支，批號：110323）；Ica 組的小鼠灌胃劑量為20 mg/kg，（換算方法：TG 人的用藥劑量為1 mg/kg，Ica 人的用藥劑量為2.2 mg/kg，查人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表得到人與小鼠的系數(shù)為0.002 6，TG：給藥1.0 × 70＝70 mg，于是小鼠的使用劑量為70 × 0.002 6/0.02＝9.1 mg/kg；Ica 苷70 kg 人給藥2.2 × 70＝154 mg，于是小鼠的使用劑量為154×0.002 6/0.02＝20 mg/kg）。

1.3 HE 染色檢測骶髂關節(jié)組織學改變于首次注射蛋白聚糖后第6、8、12、16、20 和24 周，取各組小鼠骶髂關節(jié)固定在4%的福爾馬林中，4 ℃條件下0.5 mol/L EDTA 脫鈣直至骨組織變得柔軟，石蠟組織包埋，切片，觀察；應用HE 染色檢測骨破壞或病理性骨化情況。

1.4 MicroCT 檢測骨密度和骶髂關節(jié)骨化情況將小鼠麻醉后，置于MicroCT 下進行掃描觀測，對準骶髂關節(jié)平面以及L1～4平面和股骨平面，掃描層間距為12 μm，分辨率為12.5 μm，電壓為80 kV，電流為0.18 mA，功率為9 W，掃描角度為14 400，每秒1 幀，將每個樣本進行三維重建，觀測小鼠骶髂關節(jié)病理性骨化情況，并測量椎體骨密度的改變。

1.5 Real-time PCR 檢測骶髂關節(jié)BMP-2、ALP，OCNmRNA 以及miR-21 的表達為了探討雷公藤多苷以及淫羊藿苷治療AS 可能的作用機制，本研究應用Real-time PCR 對成骨相關基因BMP-2、ALP，OCN mRNA 以及miR-21 進行定量分析并進行比較。骶髂關節(jié)組織總RNA 的提取及逆轉錄從樣本保存液中取出，根據(jù)RNA 提取試劑盒上的操作步驟進行（TAKARA，日本）。RT-PCR 反應以GAPDH 和U6 作為內(nèi)標基因，設計BMP-2、ALP，OCN mRNA 以及miR-21 四種引物的序列：BMP-2：F：5′-GCTTCCGCTGTTTGTGTTTG-3′，R：5′-GGTCACAGATAAGGCCATTGCGAPDH-3′；OCN-F：5′-GGACATTACTGACCGCTCCT-3′-R：5′-TTTTCAGTGTCTGCCGTGAG-3ALP F：5′-ACGAGGTCACGRCCATCCT-3′，R：5′-CCGAGTGGTGGTCACGAT-3′miR-21：F：5′-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3′，R：5′-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3′GAPDH：F：5′-GAATTTGCCGTGAGTGGAGT-3′R：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′；U6，F(xiàn)：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC - 3′ ， R：5′ - AAATATGGAACGCTTCACGA -3′反應條件均為：95 ℃3 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s，循環(huán)40 次。每標本檢測2 次。根據(jù)最終的優(yōu)化體系，比較目的基因與內(nèi)標基因GAPDH 和U6 的擴增效率的斜率回歸有無顯著性差異。如果沒有顯著性差異，應用比較閾值法即2-△△Ct，所得結果表示目的基因相對于正常對照組的倍數(shù)，如果有顯著性差異，按Rasmussen 計算出相對表達差異，每次實驗均重復3次。

1.6 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計學方法應用Graphpad Prism 6.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠造模觀測在第9 周左右觀察到小鼠外周關節(jié)紅、腫等關節(jié)炎等表現(xiàn)。第16 周小動物MRI 顯示骶髂關節(jié)出現(xiàn)不同程度的破壞，表明造模成功（圖1A）。HE 染色病理分析顯示PGIA 模型病變關節(jié)主要表現(xiàn)為淋巴細胞的浸潤和組織水腫，并伴有關節(jié)間隙多型核細胞的浸潤以及滑膜巨噬細胞和成纖維樣細胞的增殖，骶髂關節(jié)軟骨侵蝕（圖1B）。

圖1 造模后骶髂關節(jié)變化情況Fig.1 Change of sacroiliac joint after AS modeling

圖2 TG 聯(lián)合Ica 對骶髂關節(jié)病理性成骨的影響Fig.2 Effect of TG and Ica on the pathological bone formation in sacroiliac joint

2.2 雷公藤多苷聯(lián)合淫羊藿苷對病理性成骨的影響與空白對照組（圖2D）相比較，TG 組骶髂關節(jié)局部有炎癥稍有少許新骨增生（圖2A），TG 聯(lián)合Ica 組骶髂關節(jié)稍有新骨形成但未發(fā)生關節(jié)間隙未融合（圖2B），而單純生理鹽水組骶髂關節(jié)發(fā)生破壞幾乎完全發(fā)生融合（圖2C）。表明TG 可以防止骶髂關節(jié)進一步融合，TG 聯(lián)合Ica 并未顯著性 增加骶髂關節(jié)融合。

2.3 雷公藤多苷聯(lián)合淫羊藿苷對骶髂關節(jié)成骨基因BMP-2、ALP、OCN mRNA 以及miR-21 的影響從圖3 中可以看出相對于空白對照組，單純造模組骶髂關節(jié)組成骨基因BMP-2、ALP、OCN mRNA以及miR-21 表達均顯著升高；相對于單純造模組，雷公藤多苷組和雷公藤多苷聯(lián)合淫羊藿苷組顯著抑制了各組骶髂關節(jié)成骨相關基因BMP-2，ALP 以及OCN mRNA的表達，而雷公藤多苷聯(lián)合淫羊藿苷組相對雷公藤多苷成骨基因BMP-2、ALP 以及OCN mRNA 稍有升高趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義；單純造模組miR-21 顯著高于空白對照組，但雷公藤多苷組可顯著抑制miR-21 的表達，而雷公藤多苷聯(lián)合淫羊藿苷組與雷公藤多苷組miR-21 表達差異無統(tǒng)計學意義（圖3）。這些研究結果表明，在應用雷公藤多苷的基礎上聯(lián)合應用淫羊藿苷并不會顯著增高骶髂關節(jié)病理性骨化的可能性。

2.4 雷公藤多苷聯(lián)合淫羊藿苷對小鼠股骨以及椎體骨密度的影響TG 組股骨骨密度顯著低于空白對照組，略低于單純模型組，TG 聯(lián)合Ica 組股骨骨密度顯著高于TG 組（圖4A）；TG 組以及單純模型組椎體骨密度顯著低于空白對照組和TG 聯(lián)合Ica 組（圖4B）。這些研究結果表明，Ica 可以顯著防止TG 所帶來的骨密度丟失。

圖3 TG 聯(lián)合Ica 對骶髂關節(jié)成骨基因和miR-21 的影響Fig.3 Effect of TG and Ica on the osteogenesis gene and miR-21 in sacroiliac joint

圖4 TG 聯(lián)合ICa 對小鼠股骨以及椎體骨密度的影響Fig.4 Effect of combination use of TG and Ica on the femur and spinal bone mineral density

3 討論

祖國醫(yī)學認為AS 為早期“筋痹”，脊柱關節(jié)周圍的附著點發(fā)生炎性增生等改變，表現(xiàn)在“筋”。而中晚期“骨痹”表現(xiàn)為附著點的病理性骨化，并腐蝕結合部的松質骨。如新生的骨質生成過多、整體脊柱的關節(jié)囊和韌帶病理性骨化，并且發(fā)生椎體骨小梁丟失，骨質疏松，最終出現(xiàn)“骨痿”。而AS“筋痹”到，“骨痹”再到“骨痿”之間傳變關系正符合西醫(yī)“炎癥-骨轉化”的過程。所以在早中期控制筋骨之痹，從痹論治，防止終末出現(xiàn)“骨痿”，是AS 治療成功與否的關鍵［6］。久痹者必傷腎，《千金要方》強調“腰背痛者皆是腎氣虛弱”，即是說腎虛是AS 的根本。腎虛在AS 的病情發(fā)展中起了舉足輕重的作用。因此從以上論述看來，“補腎除痹”是十分科學的防治AS 的重要治療手段［7］。

TG 是從雷公藤提取由我國自主研發(fā)的具有強大抗風濕作用的化合物，對AS 臨床療效明顯，可顯著降低AS 患者血沉和C 反應蛋白水平，還可以明顯改善晨僵，Schober 指數(shù)、疼痛和僵硬指數(shù)、外周關節(jié)和中軸關節(jié)癥狀以及功能障礙的程度，具有較高的安全性和耐受性［8］，然而TG 治療AS 的作用機制尚無定論。筆者的前期研究［9］發(fā)現(xiàn)TG的有效成分雷公藤紅素可在體外抑制AS 髖關節(jié)囊成纖維細胞的增殖和骨化；還發(fā)現(xiàn)在炎癥刺激狀態(tài)下，TG 在體外可以抑制AS 成纖維細胞miR-21 和成骨因子的表達［10］。淫羊藿苷具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、影響心腦血管系統(tǒng)和生殖等多種重要的生物活性，是一類應用前景廣闊的中藥單體。有研究［11］表明淫羊藿苷不僅可以防止骨質疏松，還可以抑制在體外抑制AS 成纖維細胞發(fā)生病理性成骨［12-13］，這為淫羊藿苷治療AS 提供了基礎。

miR-21 是調節(jié)成骨細胞分化和礦化的重要因子［14］，在成骨細胞分化時與多種成骨如ALP，BMP-2 以及OCN 等基因同時表達［15］，而最近研究發(fā)現(xiàn)miR-21 在AS 進展中具有重要作用。TNF-α 是觸發(fā)AS“炎癥因子風暴”級聯(lián)瀑布效應的關鍵因子，而研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以誘導miR-21 持續(xù)表達上調［16］。巨噬細胞是引起AS 骨破壞的主要炎癥細胞，而LPS 刺激巨噬細胞后可顯著上調miR-21 的表達，同時伴隨著TNF-α 等細胞因子分泌模式的改變。過表達miR-21 會使TNF-α 的分泌降低，調節(jié)巨噬細胞的細胞因子分泌模式，起到抗炎的作用［17］。最近HUANG 等［18］發(fā)現(xiàn)miR21 在AS 患者血清中的表達要明顯高于對照組，筆者團隊近期臨床研究［19］發(fā)現(xiàn)AS 患者血清中miR-21 表達與AS 病理性骨化呈正相關，但與椎體骨密度呈負相關。

本研究發(fā)現(xiàn)TG 可以防止骶髂關節(jié)進一步融合，但會引起骨質疏松，而TG 聯(lián)合Ica 并未顯著性增加骶髂關節(jié)融合，本研究還發(fā)現(xiàn)TG 組以及單純模型組椎體骨密度顯著低于空白對照組和TG 聯(lián)合Ica 組，表明Ica 可以顯著防止TG 所帶來的骨密度丟失，因此聯(lián)合應用TG 和Ica 既可以防止AS 小鼠病理性骨紊亂，為臨床以雷和淫羊藿為基礎的補腎除痹方治療AS 提供了實驗基礎，未來期望進一步對其潛在機制進行探討。