洪偉，饒鳳琴，吳昌學**，趙行行，程玉梅，張婷，齊曉嵐，禹文峰，官志忠

(1.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室&貴州省分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學附院 ICU，貴州 貴陽 550004)

艱難梭菌(Clostridioidesdifficile)是一種革蘭染色陽性且專性厭氧的產(chǎn)芽孢桿菌，是導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的主要病原菌[1]，艱難梭菌感染(Clostridioiesdifficileinfection，CDI)的臨床表現(xiàn)可從輕度自限性腹瀉到可致命的偽膜性結(jié)腸炎[2-3]。正常情況下，人群腸道內(nèi)微生物處于動態(tài)平衡狀態(tài)，抗生素的使用會擾亂腸道內(nèi)微生物群落的平衡，進而導(dǎo)致有益微生物種類和數(shù)量減少，對艱難梭菌的阻遏效應(yīng)被解除。阻遏效應(yīng)解除后，艱難梭菌迅速占據(jù)腸道生態(tài)位，大量繁殖并產(chǎn)生毒素A(toxinA，TcdA)和毒素B(toxinB，TcdB)，這些毒素損傷腸上皮細胞、導(dǎo)致腸道炎癥，最終導(dǎo)致CDI的發(fā)生[4]。在CDI發(fā)生的過程中，艱難梭菌黏附于腸細胞，引發(fā)免疫反應(yīng)[5]。真核細胞核因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路被認為是細胞內(nèi)調(diào)控細胞炎癥產(chǎn)生的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[6-7]，研究認為TcdA可在體外激活單核細胞NF-κB信號通路[8]，用純化的艱難梭菌毒素感染巨噬細胞會激活炎癥相關(guān)通路NF-κB信號通路、且艱難梭菌毒素會引起小鼠腸道炎癥反應(yīng)[9-10]。目前尚無艱難梭菌感染人克隆結(jié)腸腺癌細胞(Caco-2)是否會引起NF-κB信號通路激活的研究報道，本研究探討艱難梭菌感染Caco-2細胞與NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的表達關(guān)系，為防治CDI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司；革蘭染料和BHI腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基購自Solarbio公司，艱難梭菌純化毒素A、毒素B、兔抗IκBα、P-p65、p65、IKKα及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗均購自Abcam公司；SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物、蛋白分子量標準購自Absin公司，細胞核熒光染料DAPI購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自Immobilon公司，厭氧產(chǎn)氣袋購自日本三菱公司。

1.2 方法

1.2.1細菌培養(yǎng) 艱難梭菌菌株由貴州醫(yī)科大學重癥監(jiān)護科患者糞便樣品分離[11]，接種于新鮮配制的BHIS培養(yǎng)基，37 ℃厭氧(80% N2，10% H2，10% CO2)培養(yǎng)48 h，生化鑒定、傳代。液體培養(yǎng)24 h后2 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集細菌、重懸于無抗生素 DMEM 培養(yǎng)液中，紫外分光光度計測量OD600的吸光度值，將菌懸液調(diào)至1×1010CFU/L備用。

1.2.2細胞培養(yǎng) Caco-2 細胞用10%胎牛血清細胞培養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)在5% CO2，37 ℃環(huán)境，然后將Caco-2細胞鋪于6孔板或者T25培養(yǎng)瓶。

1.2.3顯微鏡觀察艱難梭菌與細胞黏附 用6孔板做細胞爬片，將Caco-2細胞鋪于6孔板，待細胞完全貼滿爬片時，更換新鮮培養(yǎng)基，加入艱難梭菌至感染復(fù)數(shù)(MOI=100)，分別共培養(yǎng)3、6、9、12及24 h，PBS洗2次，用甲醇于-20 ℃固定5～10 min，分別用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和革蘭染料染色，使用油鏡觀察(放大倍數(shù)100倍，每個樣本取30個視野)，單盲法計數(shù)，每組實驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.4Western blot 實驗 Caco-2細胞培養(yǎng)至鋪滿T25培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，更換新鮮培養(yǎng)基，分別用毒素TcdA、TcdB和艱難梭菌直接感染。毒素感染處理分組如下：TcdA毒素感染Caco-2細胞組(TcdA+Caco-2組)，TcdB毒素感染Caco-2細胞組(TcdB+Caco-2組)，不加任何毒素的Caco-2細胞對照組(Caco-2 24 h組)。TcdA+Caco-2組加入終濃度為30 mg/L 的TcdA毒素蛋白，TcdB+Caco-2組加入終濃度為30 mg/L 的TcdB毒素蛋白，Caco-2 24 h組不加任何毒素，培養(yǎng)24 h；艱難梭菌直接感染分組為：艱難梭菌直接感染Caco-2組(C.difficile+Caco-2組)和不加艱難梭菌的Caco-2對照組(Caco-2 12組)。C.difficile+Caco-2組以MOI=100加入艱難梭菌感染Caco-2細胞，Caco-2組不加艱難梭菌，培養(yǎng)12 h。所有分組培養(yǎng)后，均提取蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg蛋白樣品進行蛋白質(zhì)免疫印跡，每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 艱難梭菌與Caco-2黏附

艱難梭菌與細胞黏附后，分別用細胞核熒光染料DAPI染色和革蘭染色。顯微鏡觀察可見小桿狀的艱難梭菌和類似卵圓形的Caco-2細胞核。見圖1。

未加艱難梭菌的Caco-2細胞對照組 艱難梭菌黏附于Caco-2細胞組圖1 DAPI和革蘭染色艱難梭菌與Caco-2細胞黏附情況(1 000×)Fig.1 Microscopic observation of DAPI staining and Gram staining of C. difficile adherence to Caco-2 cells

為統(tǒng)計艱難梭菌與Caco-2細胞的黏附情況，將艱難梭菌感染Caco-2細胞3 h、6 h、9 h、12 h及24 h，革蘭染色、制片，在1 000×油鏡下觀察，統(tǒng)計黏附細菌與細胞比值，見圖2?？梢姼腥?、6、9、12及24 h時，平均每個Caco-2 細胞上黏附的艱難梭菌個數(shù)分別為2.7、3.2、4.2、5.5及4.3。

圖2 艱難梭菌黏附Caco-2細胞 Fig.2 Clostridioides difficile adherence to Caco-2 cells

2.2 毒素A和B感染Caco-2細胞后NF-κB信號通路p65蛋白表達

用艱難梭菌毒素A和毒素B感染Caco-2細胞后，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測NF-κB信號通路磷酸化p65蛋白(P-p65)和p65總蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，TcdA和TcdB感染組P-p65蛋白均升高(P<0.05)，p65總蛋白水平降低。見圖3。

注：(1)與Caco-2組比較，P<0.05。圖3 艱難梭菌毒素感染Caco-2細胞對P-p65和p65表達水平的影響Fig.3 The effect of C. difficile Toxins on the expression levels of p-P65 and P65 proteins in Caco-2 cells

2.3 艱難梭菌感染Caco-2細胞后NF-κB通路P-p65、p65總蛋白、IKKα及IκBα 蛋白表達

艱難梭菌與Caco-2細胞共培養(yǎng)12 h，蛋白質(zhì)免疫印跡檢測NF-κB信號通路磷酸化p65蛋白、p65總蛋白、IKKα及IκBα蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，細菌共培養(yǎng)組P-p65和IKKα均升高(P<0.05)，IκBα和p65總蛋白表達均降低(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與Caco-2細胞比較，P<0.05。圖4 艱難梭菌感染Caco-2細胞對P-p65、p65、IKKα及IκBα表達水平的影響Fig.4 The effect of C. difficile on the expression of P-p65, p65, IKKα and IκBα in Caco-2 cells

3 討論

近年來，艱難梭菌感染引起的腸道炎癥越來越受到研究者的關(guān)注[12-14]。偽膜性結(jié)腸炎是以艱難梭菌為病原體引起的炎癥性腸道疾病，嚴重時可導(dǎo)致死亡[15-16]。NF-κB在機體的細胞增殖、凋亡及免疫反應(yīng)等方面起到關(guān)鍵作用。生理狀態(tài)下，NF-κB 與其抑制因子(inhibitor of kappa B，IκB)結(jié)合為復(fù)合體存在于胞質(zhì)中，處于相對休眠狀態(tài)，在細菌入侵或者其他信號刺激下，IκB 在蛋白水解酶的作用下降解，NF-κB被激活，從細胞質(zhì)進入細胞核，引發(fā)其他炎癥因子釋放，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[17-18]。Batah Jameel等人發(fā)現(xiàn)艱難梭菌菌株中提取的鞭毛蛋白可通過Toll-like receptor 5(TLR5)促進腸道上皮細胞中NF-κB和MAPKs信號通路的激活[19-20]，提示了艱難梭菌的存在可能會引起腸道上皮細胞的激活。為了驗證這一猜想，本研究首先驗證了用TcdA和TcdB感染Caco-2細胞24 h會引起NF-κB信號通路蛋白p65磷酸化升高，總p65蛋白表達降低，提示了艱難梭菌毒素能夠激活NF-κB信號通路，促進炎癥的發(fā)生。

為了驗證艱難梭菌直接感染是否有相同的促炎作用，本研究首先建立了艱難梭菌黏附Caco-2細胞的感染模型，發(fā)現(xiàn)感染12 h黏附細菌數(shù)最多。使用免疫印跡檢測NF-κB信號通路蛋白P-p65、p65、IKKα及IκBα，結(jié)果顯示，P-p65和IKKα蛋白表達增加，總p65蛋白和IκBα蛋白表達降低。當NF-κB信號通路被激活時，激活I(lǐng)KKα，IKKα將IκBα蛋白磷酸化，使其蛋白酶體降解，IκBα表達降低，核外總p65蛋白被部分磷酸化，還有部分會入核，故P-p65蛋白表達增加，而p65總蛋白在核外表達減少[21]。本實驗結(jié)果提示了艱難梭菌直接感染Caco-2細胞可能激活NF-κB信號通路，此通路是炎癥反應(yīng)通路中很重要的一環(huán)。炎癥反應(yīng)是一把“雙刃劍”，可能使疾病更加嚴重，成為轉(zhuǎn)化為腫瘤的標志，也可能使機體發(fā)揮免疫防御，成為清除病原體的標志[22-23]。因此，進一步研究艱難梭菌感染的免疫機制，對于CDI的防治提供新的參考具有重要意義。

綜上，本研究建立了艱難梭菌感染的體外模型，揭示了艱難梭菌直接感染Caco-2細胞后可上調(diào)P-p65和IKKα蛋白的表達，同時下調(diào)總p65蛋白和IκBα蛋白的表達，從而激活NF-κB信號通路，促進了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。