周威, 薛雨晨, 賀智勇, 肖婷, 姜豐, 周雪, 吳林菁, 沈祥春, 陶玲

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州省天然藥物資源高效利用工程中心，貴州省普通高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽(yáng)市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

燈盞花乙素(scutellarin,DZ)又名野黃芩苷及5, 6, 4’-三羥基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷，是從菊科植物飛蓬屬短葶飛蓬(erigeronbreviscapusHand. -Mazz)的干燥全草燈盞細(xì)辛中提取分離得到的黃酮類化合物[1]。DZ具有散寒解表、舒筋活絡(luò)、活血化瘀等作用，臨床上主要用于治療缺血性心腦血管疾病，如腦栓塞、心絞痛和心肌梗塞等[2-3]。但是DZ的水溶性和脂溶性均不佳，Beagle犬口服后的生物利用度僅為(0.40±0.19)%[4]。因此，DZ的理化性質(zhì)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)嚴(yán)重限制了其普通片劑、顆粒劑等血管外給藥劑型的吸收，注射劑、注射粉針劑又具有病人順應(yīng)性差的特性，使其臨床療效難以充分發(fā)揮[5]。磷脂復(fù)合物(phospholipid complex,PC)是指在非質(zhì)子傳遞體系溶劑中，藥物與磷脂以一定的配比關(guān)系結(jié)合而成的復(fù)合物[6-8]，既可以增強(qiáng)水溶性藥物的脂溶性，也可以增強(qiáng)脂溶性藥物的水溶性，從而改善藥物的膜滲透性，使藥物在胃腸道中的吸收增加，提高其生物利用度和療效。固體分散體(solid dispersion，SD)是指將藥物高度分散于固體載體中形成的一種以固體形式存在的分散系統(tǒng)[9-10]，如果藥物以分子或者無定型狀態(tài)高度分散于載體中可以提高藥物的釋放度，因此制備成固體分散體是提高藥物溶出度最常用的方法之一[9-10]。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是常用的水溶性載體，被廣泛用于制備固體分散體[5]。本課題組前期研究以復(fù)合率為指標(biāo)，對(duì)DZ緩釋微球制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化[11]；本次研究以DZ累積釋放百分率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選燈盞花乙素磷脂復(fù)合物固體分散體(solid dispersion of scutellarin phospholipid complex，DZ-PC-SD)處方和制備工藝，并進(jìn)行小腸吸收研究，旨在為改善DZ口服制劑吸收提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要藥品、試劑及儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠24只，雌雄兼用，體質(zhì)量(240±20)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(黔)2012-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房,光照黑暗時(shí)間各為12 h,室溫(25±5)℃。

1.1.2主要藥品與試劑 DZ-PC和DZ-PC-SD系本實(shí)驗(yàn)室自制，DZ對(duì)照品(批號(hào)110842-201207, 中國(guó)食品藥品檢定研究院)，DZ原料藥(批號(hào)BN022201311251,純度95%,上海一基生物科技有限公司)。注射用大豆磷脂(批號(hào)20140702,磷脂酰膽堿含量≥90%,上海太偉藥業(yè)有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮K17 (polyvinylpyrrolidone K17,PVPK17,批號(hào)20151106,密森科技有限公司)，聚乙烯吡咯烷酮K30 (polyvinylpyrrolidone K30,PVPK30,批號(hào)20151123,密森科技有限公司)，聚乙二醇6 000(批號(hào)Q/STXH 339-2011,分子質(zhì)量6 000～9 000 Da, 西隴化工股份有限公司)。

1.1.3儀器 SHZ-88型水浴恒溫振蕩器(金壇醫(yī)療儀器廠)，SQG-4型四腔器官浴槽系統(tǒng)(成都儀器廠)，HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋(金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，08-2G型恒溫磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)，AF2型吉印超靜音增氧氣泵(杭州吉印智能科技有限公司)，UV-5800PC型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1DZ含量測(cè)定方法的建立 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3、0.5、1.0、1.5、2.0及2.5 mL，置于25 mL量瓶中，加參考文獻(xiàn)配制的Tyrode緩沖液[12-13]，定容至刻度，配成系列濃度分別為2.4、4.0、8.0、12.0、16.0及20.0 mg/L的對(duì)照品試液。根據(jù)最大吸收波長(zhǎng)考察結(jié)果，以Tyrode緩沖液作為空白試劑，于334 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，繪制A-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察精密度、穩(wěn)定性及回收率。

1.2.2DZ-PC-SD制備 根據(jù)文獻(xiàn)及本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果[11,14-15]，稱取適量DZ、DZ-PC或DZ-PC-SD置入透析袋中，加0.01 mol/L (pH 6.8)的PBS溶液(含0.02%疊氮鈉)1 mL；將透析袋放入含PBS溶液離心管中，在37 ℃恒溫水浴振蕩器中振搖(轉(zhuǎn)速100 r/min)，分別在5～240 min取出樣品溶液，于334 nm處測(cè)定吸光度(A)。計(jì)算DZ累積釋放百分率，繪制溶出度曲線, 依次考察DZ-PC與PVPK17、PVPK30、PEG6000載體材料及其投藥比, 二氯甲烷-乙醇的不同配比、溶劑體積對(duì)DZ-PC-SD制備的影響。

1.2.3大鼠離體腸吸收試驗(yàn) 采用離體外翻腸囊法, 將SD大鼠隨機(jī)分成 DZ組、DZ-PC組、DZ-PC-SD(PEG6000)組及DZ-PC-SD(PVPK17)組，每組6只。大鼠禁食12 h后斷頸處死開腹，剪取大鼠十二指腸、空腸、回腸各腸段沖洗、翻轉(zhuǎn)后的腸段結(jié)扎成小囊，在37 ℃四腔器官浴槽、供氧下依次考察DZ、DZ-PC、DZ-PC-SD(PEG6000)和DZ-PC-SD(PVPK17)的離體腸吸收情況。分別于15、30、45、60、90及120 min從腸囊內(nèi)取樣0.5 mL，同時(shí)補(bǔ)充等體積Tyrode緩沖液。置于5 mL量瓶中定容，續(xù)濾液在334 nm處測(cè)定A，計(jì)算DZ腸囊累積吸收量(Q)。將藥物的累積吸收量Q對(duì)時(shí)間t作相關(guān)回歸分析，求藥物腸吸收速率常數(shù)(Ka), 根據(jù)決定系數(shù)(r2)判定曲線的擬合情況[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DZ含量測(cè)定方法驗(yàn)證

2.1.1體外釋放DZ含量測(cè)定方法驗(yàn)證 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[12]，以PBS作為空白試劑，DZ在2.4～24.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為A=0.053C-0.005 9，r=0.999 7。精密度RSD0.2%,穩(wěn)定性RSD0.5%～1.3%，重復(fù)性RSD0.4%～0.9%，回收率99.6%～101.5%,RSD1.1%。

2.1.2離體腸吸收DZ含量測(cè)定方法驗(yàn)證 在2.4～20.0 mg/L范圍內(nèi), 擬合得到DZ線性回歸方程為A=0.045 1C+0.024 7(r=0.999 9)。12 mg/L的DZ對(duì)照品溶液，RSD為0.22%；16、12、8 mg/L的供試品Tyrode溶液日內(nèi)RSD為1.85%，日間RSD為1.44%；用空白腸液分別配制16、12及8 mg/L的供試品溶液得到高、中及低3個(gè)濃度樣品的回收率范圍98.86%～100.65%，平均回收率99.58%，RSD為1.44 %。

2.2 DZ-PC-SD

2.2.1DZ-PC 基于實(shí)驗(yàn)考察前期數(shù)據(jù)，本次DZ-PC的最佳制備工藝確定為DZ ∶PC為1 ∶3，水浴溫度為35 ℃，DZ投藥量600 mg，反應(yīng)時(shí)間2.5 h，制備多批DZ-PC制劑，平均復(fù)合率為(98.72±0.42)%，RSD< 5.0%。

2.2.2載體材料、溶劑種類和溶劑體積的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)DZ-PC ∶PVPK17 為1 ∶1時(shí)，DZ在240 min內(nèi)的累積釋放率接近100%；當(dāng)DZ-PC ∶PEG6000為1 ∶2時(shí)，其累積釋放率接近100% ；二氯甲烷 ∶乙醇為1 ∶0時(shí)，DZ在240 min內(nèi)的累積釋放百分率最大；當(dāng)溶劑體積為10 mL、240 min時(shí)，其中 DZ累積釋放百分率為100%。綜上，選擇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑DZ-PC ∶PEG6000為1 ∶2時(shí)水浴溫度40 ℃、二氯甲烷10 mL制備DZ-PC-SD。見圖1、圖2。

2.2.3驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述考察結(jié)果，確定DZ-PC-SD的最佳制備工藝是DZ-PC ∶PEG6000為1 ∶2，二氯甲烷為10 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑時(shí)水浴的溫度40 ℃，按照最佳工藝制得的3批DZ-PC-SD(PEG6000), 它們?cè)?40 min時(shí)間內(nèi)的平均累積釋放率達(dá)到(99.35±1.14)%，RSD<5.0%。

2.3 大鼠離體腸吸收實(shí)驗(yàn)

隨著藥物在腸道內(nèi)作用時(shí)間的持續(xù)(給藥45 min之后), 十二指腸不斷增加對(duì)DZ的吸收,成為各DZ制劑中DZ的主要吸收腸段,然后是回腸、空腸，見表1；DZ、DZ-PC、DZ-PC-SD(PEG6000)和DZ-PC-SD(PVPK17)在不同腸段的吸收均符合零級(jí)吸收動(dòng)力學(xué)模型,r2介于0.906 2～0.995 1，不管是單一DZ成分,還是不同DZ制劑,DZ在十二指腸中的吸收都優(yōu)先考慮零級(jí)吸收動(dòng)力學(xué)模型(r20.980 4～0.995 1),其次為一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，見表2；與DZ比較，DZ-PC、DZ-PC-SD(PEG6000)及DZ-PC-SD(PVPK17)在各個(gè)腸段的Ka差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，可見DZ在不同腸段的總體吸收趨勢(shì)為：十二指腸>空腸>回腸。其中以DZ-PC-SD(PEG6000)在十二指腸的吸收最強(qiáng),Ka最高，與DZ比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

注：A為DZ-PC ∶PVPK17，B為DZ-PC ∶PVPK30，C為DZ-PC ∶PEG6000。圖1 不同載體的DZ-PC-SD釋放曲線Fig.1 DZ-PC-SD release curves of different carriers

注：A為溶劑種類，B為溶劑體積，C為水浴溫度。圖2 常規(guī)制備因素對(duì)DZ-PC-SD釋放曲線的影響Fig.2 Effect of conventional preparation factors on DZ-PC-SD release curve

表1 DZ、DZ-PC、DZ-PC-SD(PEG6000)及DZ-PC-SD(PVPK17)在不同腸段的累積吸收量Tab.1 Cumulative absorption of DZ，DZ-PC，DZ-PC-SD(PEG6000) and DZ-PC-SD(PVPK17) in different intestinal segments

表2 DZ、DZ-PC、DZ-PC-SD(PEG6000)及DZ-PC-SD(PVPK17)在不同腸段累積吸收量的線性回歸方程Tab.2 Linear regression equation of cumulative absorption DZ，DZ-PC，DZ-PC-SD(PEG6000) and DZ-PC-SD(PVPK17) in different intestinal segments

表3 DZ、DZ-PC、DZ-PC-SD(PEG6000)及DZ-PC-SD(PVPK17)在小腸的吸收速率常數(shù)Tab.3 DZ，DZ-PC，DZ-PC-SD(PEG6000) and DZ-PC-SD(PVPK17) absorption rate constant in the small intestine

注：(1)與DZ比較,P<0.01。

3 討論

DZ水溶性差, 口服生物利用度低嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用, 本研究基于磷脂復(fù)合物、固體分散體制劑的優(yōu)點(diǎn),嘗試DZ-PC-SD的制備。以DZ體外累積釋放百分率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)優(yōu)選了DZ-PC-SD的最佳處方和工藝，借用經(jīng)典溶劑法制備DZ-PC-SD，著重考察了不同類型載體材料、溶劑和溶劑體積用量對(duì)DZ-PC-SD制備的影響[5]。本研究結(jié)果表明，水溶性載體材料PEG6000能夠明顯增加DZ-PC-SD的體外釋放度, 隨著該載體比例增加，DZ累積釋放率先增大后減小，有理由推斷是載體比例增加到一定程度以后，阻礙了DZ-PC-SD藥物釋放速率。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶劑揮發(fā)水浴溫度(30～58 ℃)對(duì)體外累積釋放百分率的影響不大，建議選擇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑時(shí)水浴的溫度為40 ℃為宜。在各蒸發(fā)時(shí)水浴溫度下，240 min DZ累積釋放率均接近100%。確定DZ-PC-SD(PEG6000)優(yōu)于其他DZ-PC-SD制劑，該DZ-PC-SD(PEG6000)的最佳制備工藝是DZ-PC ∶PEG6000為1 ∶2，二氯甲烷為10 mL，240 min時(shí)間內(nèi)的平均累積釋放率達(dá)到(99.35±1.14)%，RSD< 5.0%。實(shí)驗(yàn)考察數(shù)據(jù)表明本次優(yōu)化的DZ-PC-SD制備工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好, 值得推廣應(yīng)用在燈盞花乙素現(xiàn)代制劑開發(fā)中。

圍繞制備的的DZ-PC、DZ-PC-SD, 進(jìn)一步開展藥物腸吸收實(shí)驗(yàn), 能夠更加全面考察和評(píng)價(jià)不同DZ制劑。本次采用的離體外翻腸囊法是在體外培養(yǎng)小腸腸環(huán)技術(shù)和刷狀緣膜囊技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，將實(shí)驗(yàn)大鼠的小腸取出，將所需十二指腸、空腸和回腸腸段分割出來，外翻使腸黏膜向外，結(jié)扎一端形成腸囊狀。根據(jù)囊內(nèi)外被測(cè)物質(zhì)的變化來反應(yīng)腸道對(duì)物質(zhì)吸收狀況的一種生理學(xué)試驗(yàn)方法。該方法保留了腸囊組織的完整性，能避免腸道吸收或者水分對(duì)灌流液的影響，便于了解不同藥物制劑在不同腸道吸收部位的吸收特征, 指導(dǎo)后續(xù)藥物劑型的優(yōu)化開發(fā)。本次大鼠小腸離體吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與原料藥DZ相比，DZ-PC、DZ-PC-SD在各腸段的吸收差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這可能與DZ-PC、DZ-PC-SD對(duì)DZ親脂性的提高有關(guān)。PC與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，具有細(xì)胞親和力，與藥物結(jié)合后，能夠增強(qiáng)DZ與腸壁細(xì)胞的親和力，使DZ更易透過腸壁細(xì)胞膜，從而提高了DZ-PC、DZ-PC-SD制劑中DZ在各吸收部位的滲透能力，進(jìn)而提高DZ的腸吸收速度[13，15-17]。

本次研究將DZ-PC進(jìn)一步開發(fā)制備成DZ-PC-SD(PEG6000)后，該制劑在大鼠十二指腸的吸收速率常數(shù)Ka比DZ-PC更高，為后者的1.54倍，這可能是DZ-PC-SD可明顯增加DZ-PC的分散，使DZ-PC-SD(PEG6000)制劑中DZ-PC在比表面積方面更大，使得其DZ吸收顯著增多。腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本次研究成功制備了新型DZ-PC-SD(PEG6000)制劑，該制劑工藝簡(jiǎn)單、重復(fù)性好, 能夠很好改善DZ自身水溶性差, 口服生物利用度低的不足[18]。本研究將磷脂復(fù)合物與固體分散體相結(jié)合對(duì)于改善親水親油均比較差的口服制劑吸收具有良好的借鑒意義。

與此同時(shí), 本研究還建立了圍繞DZ的DZ、DZ-PC和DZ-PC-SD制劑中DZ的一般含量測(cè)定方法，以及這類DZ藥物制劑在離體腸吸收實(shí)驗(yàn)中含有DZ生物樣品的DZ含量分析方法。對(duì)該兩種光譜分析方法進(jìn)行了方法學(xué)考察，分別是：(1)一般制劑的DZ體外含量測(cè)定方法的精密度和穩(wěn)定性RSD<1.3%, 回收率99.6%～101.5%；(2)離體腸吸收生物樣品DZ含量分析方法的精密度和穩(wěn)定性RSD<1.85%, 回收率98.86%～100.65%。方法學(xué)考察數(shù)據(jù)表明這兩種分析方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率均符合方法學(xué)考察要求, 該分析方法專屬性較好、分析效率高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確, 適用于大批量DZ制劑與生物樣品的高通量分析。

綜上所述，本次研究采用溶劑法成功開展了DZ-PC-SD的制備研究，制備工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠，DZ-PC和DZ-PC-SD均能有效增加燈盞花乙素在離體腸道的吸收，以DZ-PC-SD(PEG6000)為最佳，證明了DZ-PC-SD制劑工藝的科學(xué)性和正確性[19-21]；建立的一般體外DZ含量測(cè)定、腸吸收DZ生物樣品中DZ濃度檢測(cè)方法經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、準(zhǔn)確、實(shí)用，值得推廣應(yīng)用。