何美玲，楊喆，戴研平，雷珊，高曉勤

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563006)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是人類消化道的惡性腫瘤之一，其病情進(jìn)展迅速易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化學(xué)抗性，通常患者確診時(shí)已為晚期[1-2]。對(duì)PC治療有手術(shù)切除、化學(xué)療法和放射療法等多種手段，但患者5年生存率仍低于5%[2-3]。因此，詳細(xì)了解PC發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)尋找新的PC生物標(biāo)志物和治療策略的發(fā)展具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)是一類長度超過200個(gè)核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的 RNA，在多種細(xì)胞病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用，如增殖、凋亡、去分化、周期阻滯、侵襲和遷移等[4-5]。LncRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象在各種腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)，提示lncRNA可能是潛在的致癌或抑癌的RNA[6-9]。Linc00152是一種定位于2號(hào)染色體(2p11.2)的LncRNA[10]，研究表明其在多種類型的癌癥中參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[11-14]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Linc00152在胰腺癌組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)，影響胰腺癌患者的生存預(yù)后，但Linc00152在胰腺癌中的相關(guān)功能及影響尚不清楚。本研究通過干擾胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2和SW1990中Linc00152的表達(dá)，研究Linc00152對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，為尋找胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

胰腺癌細(xì)胞株MIA PaCa-2和SW1990購自美國ATCC細(xì)胞庫，胎牛血清(FBS)、轉(zhuǎn)染用OPTI-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，RT試劑盒、PCR相關(guān)SYBRP、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自鼎國生物有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，細(xì)胞周期試劑盒購自美國Thermo公司，兔抗人單克隆抗體細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)以及鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自武漢賽威爾生物技術(shù)有限公司，Lipofectamine 2000和相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，Linc00152的下調(diào)siRNA序列TAGGCGATACGATGCTTTA-3′、陰性對(duì)照(NC)序列TAATCGCTACGATGCACTA-3′及RT-qPCR相關(guān)的Linc00152和GAPDH上游、下游引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，Linc00152上游引物5′-AAAATCACGACTCAGCCCCC-3′、下游引物5′-AATGGGAAACCGACCAGACC-3′，GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2和SW1990分別培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，均放置于在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；根據(jù)Lipofectamine 2000操作說明轉(zhuǎn)染NC及Si-Linc00152序列，實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(NC組)和Linc00152干擾組(Si-Linc00152組)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后, 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)時(shí)熒時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)驗(yàn)證Linc00152的干擾效率 收集各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，在TRIzol 試劑，離心、萃取，加異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌，DEPC水溶解，測(cè)RNA純度和濃度。取總RNA 1 000 ng配制RT反應(yīng)液，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按說明書配好PCR反應(yīng)液后，瞬時(shí)離心，上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增Linc00152以及內(nèi)參基因GAPDH，通過2-(ΔΔCT)法計(jì)算Linc00152的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化各組細(xì)胞株，終止消化并重懸細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞，接種到96孔培養(yǎng)板中；于6、24、48、72和96 h時(shí)，將 CCK-8的溶液加入每個(gè)孔中，在37 ℃下孵育2 h；取出96孔培養(yǎng)板上酶標(biāo)儀，在450 nm處檢測(cè)CCK-8的吸光度，根據(jù)吸光度描繪曲線。

1.2.4平板克隆細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化各組對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞株，用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸，分別接種到6 cm培養(yǎng)皿中，調(diào)整密度為每皿1 200個(gè)。然后在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃溫育8 d，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后，用4%多聚甲醛固定30 min后，倒掉甲醛，加入結(jié)晶紫染液染色30 min，倒掉結(jié)晶紫液，純水清洗、拍照，并計(jì)數(shù)染色的集落形成數(shù)目。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 分別將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞株接種于6孔板培養(yǎng)72 h，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度1×107個(gè)/L，70%乙醇-20 ℃固定過夜后，離心棄上清，加PBS洗凈重懸，加入RNA酶、碘化丙啶在37 ℃下避光放置30 min，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。用CellQuest 軟件、ModFit 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各組細(xì)胞周期的分布。

1.2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1及CDK4表達(dá) 取出轉(zhuǎn)染48 h后的各組PC細(xì)胞株，加RIPA蛋白裂解液，低溫離心，提取總蛋白，加入BCA顯色劑，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白變性10 min，按配方配制SDS-PAGE膠，電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜；次日加二抗于搖床上室溫孵育2 h。上曝光機(jī)，加ECL化學(xué)發(fā)光混合液，曝光顯影，Image J軟件用于分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，統(tǒng)計(jì)圖分析蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率及干擾效率

利用siRNA構(gòu)建干擾模型 48 h，與NC組比較, Si-Linc00152組的Linc00152表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

注：(1)與NC組比較，P<0.01。圖1 轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞Linc00152相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The relative expression of Linc00152 after transfection

2.2 干擾Linc00152后胰腺癌細(xì)胞增殖能力受到抑制

通過轉(zhuǎn)染Si-Linc00152干擾Linc00152的表達(dá)，結(jié)果顯示，在72和96 h兩個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，Si-Linc00152組較NC組的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

注：A為MIA PaCa-2，B為SW1990；(1)與NC組比較，P<0.01。圖2 干擾Linc00152表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 (CCK8法)Fig.2 Effect of knockdown Linc00152 on the cell proliferation of pancreatic cancer cells by CCK8 assay

2.3 干擾Linc00152后胰腺癌細(xì)胞克隆形成能力受到抑制

收集經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后的各組胰腺癌細(xì)胞，細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)8 d后，NC組MIA PaCa-2集落形成的數(shù)量為(548.3±11.6)個(gè)、Si-Linc00152組為(245.0±9.8)個(gè)，NC組SW1990集落形成的數(shù)量為(562.3±14.1)個(gè)、Si-Linc00152組為(306.0±8.4)個(gè)，Si-Linc00152組均較NC組的細(xì)胞集落形成數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

2.4 干擾Linc00152可以阻滯胰腺癌細(xì)胞周期于G0/G1期

與NC組比較，Si-Linc00152組在細(xì)胞周期中的G1期細(xì)胞所占百分比上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。提示干擾Linc00152可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞在G0/G1期細(xì)胞周期阻滯。

注：A為平板克隆實(shí)驗(yàn)，B為細(xì)胞集落形成數(shù)；(1)與NC組比較，P<0.01。圖3 干擾Linc00152表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響(克隆形成實(shí)驗(yàn))Fig.3 Effect of knockdown Linc00152 on the cell proliferation of pancreatic cancer cells by colony formation assay

注：A～D為流式細(xì)胞圖，E、F為直條圖，A、B、E為MIA PaCa-2，C、D、F為SW1990，A、C為NC組，B、D為Si-Linc00152組；(1)與NC組比較，P<0.01。圖4 干擾Linc00152表達(dá)后對(duì)細(xì)胞周期的影響 (流式細(xì)胞術(shù)) Fig.4 Effect of knockdown Linc00152 on cell cycle of pancreatic cancer cells by FCM

2.5 干擾Linc00152表達(dá)后cyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h時(shí)MIA PaCa-2和SW1990細(xì)胞蛋白表達(dá)水平變化,實(shí)驗(yàn)顯示，與NC組比較，Si-Linc00152組的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1及CDK4的表達(dá)均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖5。提示干擾Linc00152抑制了胰腺癌細(xì)胞株的增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞在細(xì)胞周期G0/G1期停滯，可能與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1及CDK4的表達(dá)減少有關(guān)。

注：A為Western blot結(jié)果，B、C分別為MIA PaCa-2、SW1990條圖；(1)與NC組比較，P<0.01。圖5 干擾Linc00152表達(dá)后對(duì)胰腺癌細(xì)胞中CyclinD1及CDK4蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The expression of CyclinD1and CDK4 proteins after knocking down Linc00152

3 討論

LncRNA已成為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并在各種癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。Linc00152(長基因間非編碼RNA 152)，是一類與癌癥相關(guān)的828 bp的lncRNA，定位于2號(hào)染色體短臂(2p11.2)[16]。有研究表明，Linc00152的高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、淋巴結(jié)侵襲和TNM分期進(jìn)展呈正相關(guān)[17]，并且在體外和體內(nèi)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[18]。盡管Linc00152逐步被證實(shí)為多種人類惡性腫瘤形成的重要的基因表達(dá)調(diào)控器，但是其與胰腺癌的關(guān)系卻尚不清楚。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，發(fā)現(xiàn)在Linc00152胰腺癌細(xì)胞株和組織中均高表達(dá)，且與生存預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾Linc00152表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞的增殖能力明顯降低；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默Linc00152后胰腺癌細(xì)胞克隆數(shù)目顯著降低；結(jié)果表明干擾Linc00152的表達(dá)可抑制MIA PaCa-2和S1990細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞周期主要由細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)驅(qū)動(dòng)，CDK通過在不同細(xì)胞周期階段與細(xì)胞周期蛋白(cyclin)結(jié)合形成特異性復(fù)合物而被激活，并促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S期調(diào)控點(diǎn)進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制，因此促進(jìn)細(xì)胞增殖，異常調(diào)節(jié)的CDK會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞不定期增殖[19]。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明，沉默Linc00152的表達(dá)后G1期MIA PaCa-2和S1990細(xì)胞增多，發(fā)生細(xì)胞周期阻滯；沉默Linc00152后cyclinD1和CDK4的表達(dá)下調(diào)，而cyclinD1和CDK4是細(xì)胞周期G1 向S期轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)劑，因此干擾Linc00152能延長G1期的持續(xù)時(shí)間，阻礙G0/G1到S期的轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細(xì)胞在細(xì)胞周期G0/G1期停滯，抑制了細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究證實(shí)干擾Linc00152在體外能抑制胰腺癌細(xì)胞株的增殖，顯示了Linc00152在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控作用，為胰腺癌的分子靶向治療提供了思路和依據(jù)。目前對(duì)Linc00152的機(jī)制研究仍然不完整，其具體的作用途徑及分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確，還需要進(jìn)一步的探索及研究。