劉琳瑞，王志強(qiáng)

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

肺癌是全球最常見(jiàn)及死亡率最高的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年我國(guó)肺癌發(fā)病例數(shù)為73.33萬(wàn)例，其中男性和女性分別占50.93萬(wàn)例和22.40萬(wàn)例，死亡例數(shù)達(dá)到61.02萬(wàn)例[1]。肺癌按病理類型分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，其中以NSCLC最多見(jiàn)，占肺癌的85%,多數(shù)NSCLC發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)展至晚期，5年生存率約為15%。近年來(lái)，隨著診療模式的轉(zhuǎn)變，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)成為腫瘤治療的熱點(diǎn)，越來(lái)越多的基因靶點(diǎn)如EGFR、KRAS、ALK、BRAF、ROS被發(fā)現(xiàn)，靶向藥物如吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、克唑替尼、塞瑞替尼、奧希替尼等相繼被批準(zhǔn)用于NSCLC的治療，本文將針對(duì)ALK在NSCLC靶向治療的研究進(jìn)展及耐藥機(jī)制作一綜述。

1 ALK與非小細(xì)胞肺癌

間變性淋巴瘤激酶(naplastic lymphoma kinase，ALK)被認(rèn)為是間變性大細(xì)胞淋巴瘤(large-cell lymphoma，ALCL)的融合基因，是一種跨膜受體酪氨酸激酶，屬于胰島素受體超家族。約3%～7%的NSCLC患者可出現(xiàn)ALK重排，主要見(jiàn)于腺癌亞型，并與KRAS和EGFR突變相互排斥。2007年，Soda等人在一組NSCLC患者中發(fā)現(xiàn)了棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(Echinoderm microtubule-associated protein-4，EML4)-ALK融合基因，系2號(hào)染色體短臂中存在倒位所致。目前已發(fā)現(xiàn)多種ALK融合基因，但以EML4-ALK最常見(jiàn)[2]。EML4-ALK形成二聚體引起構(gòu)象改變，通過(guò)自身磷酸化，活化多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。JAK-STAT、MAPK/ERK、PLCγ和PI3K-AKT途徑是四個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路，是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡/細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)因子，它們的調(diào)節(jié)失控是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的重要因素[2]。人肺癌細(xì)胞株H2228和H3122呈EML4-ALK陽(yáng)性(盡管它們攜帶不同的變異)，并用于分析ALK信號(hào)傳導(dǎo)，兩種細(xì)胞系中均觀察到磷酸化AKT、ERK和STAT3水平的升高，但ALK抑制對(duì)這些信號(hào)分子的激活狀態(tài)有不同的影響。這表明ALK抑制劑對(duì)下游信號(hào)傳導(dǎo)的影響取決于融合蛋白的性質(zhì)。EML4-ALK融合基因多見(jiàn)于年輕、少吸煙或不吸煙的NSCLC患者。

2 ALK融合基因檢測(cè)

ALK融合基因的檢測(cè)方法包括熒光原位雜交法(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)、下一代測(cè)序(Next generation sequencing，NGS)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)。FISH是檢測(cè)ALK重排的金標(biāo)準(zhǔn)，也是驗(yàn)證其他ALK檢測(cè)方法的手段之一[3]。但FISH的檢測(cè)成本及對(duì)檢測(cè)設(shè)備、檢測(cè)人員技術(shù)要求較高限制其應(yīng)用。相較于FISH，IHC檢測(cè)流程簡(jiǎn)易、價(jià)格低廉，已作為一種有效的篩查手段。RT-PCR是通過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)好的引物對(duì)樣本的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄來(lái)檢測(cè)融合突變，簡(jiǎn)便可行，但需要高質(zhì)量的RNA樣本，且該方法容易突出已知的融合，基于3′/5′端表達(dá)不平衡，易導(dǎo)致誤診，可能無(wú)法檢測(cè)到新的變異和融合伴侶[4]。目前已有證明NGS檢測(cè)基因擴(kuò)增、基因重排是可行的，可檢測(cè)已知和新的ALK融合基因，為FISH檢測(cè)提供準(zhǔn)確、有效的替代方法，以指導(dǎo)NSCLC診斷和治療。

3 靶向治療

3.1 第一代ALK抑制劑克唑替尼(Crizotinib) 2011年，也就是Soda等人發(fā)現(xiàn)ALK重排作為NSCLC中潛在的致癌驅(qū)動(dòng)因子后僅4年，crizotinib就被FDA批準(zhǔn)用于治療ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC。crizotinib是一種口服小分子ATP競(jìng)爭(zhēng)性ALK抑制劑，最初用作MET TKI，被發(fā)現(xiàn)ALK重排在NSCLC中的作用后迅速轉(zhuǎn)向ALK[2]。2013年和2014年分別報(bào)告了兩項(xiàng)隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)，比較crizotinib與第二次化療或一線化療的療效[5-6]。在第一項(xiàng)研究中，347名之前接受過(guò)鉑類化療方案治療的ALK陽(yáng)性肺癌患者，被隨機(jī)分配接受口服crizotinib或靜脈注射培美曲塞或多西紫杉醇化療。研究表明，使用crizotinib治療的患者無(wú)進(jìn)展生存期(Progression-free survival，PFS)為7.7個(gè)月，接受化療患者的PFS為3.0個(gè)月。同時(shí)接受crizotinib治療的患者客觀緩解率(Objective response rate，ORR)也更高(65%vs 20%)。第二項(xiàng)研究招募了343名未接受過(guò)晚期治療的ALK陽(yáng)性肺癌患者，被隨機(jī)分配接受口服crizotinib或靜脈注射鉑類雙藥化療(培美曲塞加順鉑或卡鉑)。與第一項(xiàng)研究相似，接受crizotinib治療的患者PFS有所改善(10.9個(gè)月vs 7.0個(gè)月)，ORR也更高(74% vs 45%)。兩項(xiàng)研究均未顯示兩組患者的總生存期(Overall survival，OS)存在顯著差異。但患者使用crizotinib治療后更大程度地減輕了肺癌的癥狀，生活質(zhì)量明顯改善。2019年美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National comprehensive cancer network，NCCN)指南推薦crizotinib為ALK陽(yáng)性的晚期NSCLC患者的一線治療。

3.2 第二代ALK抑制劑(1)塞瑞替尼(Ceritinib)和阿來(lái)替尼(Alectinib)：Ceritinib和Alectinib已被證明對(duì)許多crizotinib耐藥的ALK陽(yáng)性NSCLC有效，包括攜帶L1196M守門(mén)人突變的腫瘤[7-8]。體外酶促實(shí)驗(yàn)表明，ceritinib抑制ALK的能力是crizotinib的20倍。在I期和II期臨床試驗(yàn)中，ceritinib對(duì)crizotinib初治和crizotinib難治性患者均有反應(yīng)，與NSCLC是否存在ALK耐藥突變無(wú)關(guān)。2014年4月ceritinib被FDA批準(zhǔn)用于治療crizotinib治療后進(jìn)展或不耐受crizotinib治療的ALK陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性NSCLC患者[9]。隨機(jī)III期試驗(yàn)ASCEND-4和ASCEND-5發(fā)現(xiàn)，ceritinib同化療相比，PFS明顯延長(zhǎng)(26.3個(gè)月 vs 8.3個(gè)月)，且達(dá)到了更好的腫瘤緩解率[10]。根據(jù)ASCEND-4試驗(yàn)的結(jié)果，ceritinib于2017年5月被FDA批準(zhǔn)用于一線NSCLC治療。第二代ALK抑制劑alectinib優(yōu)于crizotinib和ceritinib，主要原因是它可以較大劑量的透過(guò)血腦屏障。大腦是接受crizotinib治療的患者的常見(jiàn)復(fù)發(fā)部位，而alectinib是伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)轉(zhuǎn)移患者的最佳選擇。一項(xiàng)ALEX(III期，NCT02075840)研究比較了303例未經(jīng)治療的晚期ALK陽(yáng)性NSCLC患者，分別口服alectinib(600mg/次，2次/d)和crizotinib(250mg/次，2次/d)，結(jié)果顯示alectinib療效明顯優(yōu)于crizotinib，兩組12個(gè)月無(wú)事件生存率為68.4% vs 48%，alectinib組中有12%的患者發(fā)生CNS進(jìn)展，crizotinib組為45%(P<0.001)，3至5級(jí)不良事件的發(fā)生率也較低(50% vs 41%)[11]?；诨颊吡己玫念A(yù)后，alectinib于2015年12月獲得FDA批準(zhǔn)，用于治療疾病進(jìn)展或?qū)rizotinib不耐受的轉(zhuǎn)移性ALK陽(yáng)性NSCLC。2017年11月，alectinib被批準(zhǔn)作為ALK陽(yáng)性NSCLC患者的一線治療，推薦劑量為600mg/次，2次/d[12]。而2019年NCCN指南推薦其為一線治療的首選藥物。(2)布吉替尼(Brigatinib)：Brigatinib是一種抑制ALK重排的口服型酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)ALK的抑制作用是crizotinib的12倍。一項(xiàng)關(guān)于brigatinib的II期臨床試驗(yàn)(ALTA)中，根據(jù)用藥方案不同分為以下兩組：A組(90mg/d)，B組(90mg/d共7d+180mg/d)，獨(dú)立審查委員會(huì)(Independent review committee，IRC)評(píng)估了A、B兩組的ORR為分別為45%和54%，腦轉(zhuǎn)移可測(cè)量者的顱內(nèi)緩解率為42%和67%，與A組相比，B組方案治療效果更佳[13]?；谶@一實(shí)驗(yàn)2017年4月brigatinib被FDA批準(zhǔn)作為ALK陽(yáng)性的NSCLC的二線治療。最近的一項(xiàng)III期實(shí)驗(yàn)比較了brigatinib與crizotinib治療ALK陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性NSCLC患者的療效，結(jié)果顯示brigatinib的PFS高于crizotinib(69% vs 43%)，顱內(nèi)緩解率也顯著高于crizotinib(78% vs 29%)[14]。基于此2019年NCCN指南推薦brigatinib作為ALK陽(yáng)性NSCLC患者的一線治療。

3.3 第三代ALK抑制劑勞拉替尼(Lorlatinib)Lorlatinib是一種高選擇性ALK/ROS1抑制劑。其克服了G1202R突變，在Ba/F3細(xì)胞中對(duì)ALK的抑制作用強(qiáng)于brigatinib[15]。一項(xiàng)I/Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT01970865)通過(guò)測(cè)定腦脊液與血漿的濃度比發(fā)現(xiàn)lorlatinib對(duì)血腦屏障有較強(qiáng)的穿透能力，因此對(duì)腦轉(zhuǎn)移患者有強(qiáng)大的顱內(nèi)治療活性[16]。此外，lorlatinib可能使NCSLC對(duì)crizotinib重新敏感。在Shaw等人的一項(xiàng)研究中，lorlatinib用于治療一例crizotinib耐藥的C1156Y ALK陽(yáng)性NSCLC患者，在lorlatinib復(fù)發(fā)后，活組織檢查顯示腫瘤除C1166Y突變外，還存在ALK L1198F突變[17]。即使如此，L1198F突變通過(guò)增強(qiáng)crizotinib與ALK的結(jié)合，可使其再次有效。另一項(xiàng)正在進(jìn)行的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)(NCT03052608)用lorlatinib和crizotinib治療進(jìn)行對(duì)比，探索對(duì)ALK陽(yáng)性NSCLC患者的安全性和有效性，期待研究結(jié)果的報(bào)道[18]。2018年11月FDA批準(zhǔn)lorlatinib治療既往接受其他ALK抑制劑治療后疾病進(jìn)展的晚期ALK陽(yáng)性NSCLC患者。

4 ALK抑制劑耐藥機(jī)制

4.1 crizotinib耐藥機(jī)制治療1～2年內(nèi)出現(xiàn)快速耐藥是限制crizotinib使用的主要因素。ALK激酶區(qū)突變是導(dǎo)致腫瘤對(duì)crizotinib耐藥的機(jī)制之一，突變類型包括G1269A、F1174C、L1152R、S1206Y、I152Tins、V1180L、C1156Y、G1202R、G1269S、L1196M。其中以L1196M最常見(jiàn)，G1269A次之[7]。L1196M又稱為“守門(mén)人”突變，它控制小分子ALK抑制劑進(jìn)入催化位點(diǎn)內(nèi)的疏水口袋。已發(fā)現(xiàn)多個(gè)通過(guò)削弱crizotinib與激酶結(jié)構(gòu)域ATP結(jié)合位點(diǎn)的親和力而產(chǎn)生的耐藥性突變，包括G1269A、S1206Y、G1202R和V1180L。crizotinib耐藥的機(jī)制還包括ALK基因拷貝數(shù)擴(kuò)增、信號(hào)傳導(dǎo)途徑旁路激活、腫瘤的異質(zhì)性。研究報(bào)道克唑替尼耐藥的腫瘤中，可觀察到在EGFR中的L858R激活突變導(dǎo)致與ALK無(wú)關(guān)的下游通路如MAPK或PI3K-AKT的異常激活[19]。EGFR以外的其他HER家族成員包括HER2和HER3的激活增加，也可能介導(dǎo)對(duì)crizotinib的繼發(fā)性耐藥。此外，IGF1R信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)已被確定為一個(gè)重要的旁路通道，在臨床前模型中阻斷IGF1R活性可使crizotinib耐藥細(xì)胞對(duì)ALK的抑制重新敏感。KIT的擴(kuò)增也是crizotinib耐藥的潛在機(jī)制。這些耐藥機(jī)制的各種組合可在部分患者中被同時(shí)被檢測(cè)出來(lái)。

4.2 Ceritinib和Alectinib耐藥機(jī)制與Ceritinib有關(guān)的耐藥突變包括G1202R、F1174L、C1156Y、1151Tins及L1152R。在Gainor等人的一項(xiàng)研究中[15]，對(duì)103例使用第一代和第二代ALK抑制劑進(jìn)展的ALK陽(yáng)性患者進(jìn)行重復(fù)活檢分析，發(fā)現(xiàn)G1202R是接受第二代ALK抑制劑患者中最常見(jiàn)的耐藥突變。G1202位于ALK激酶結(jié)構(gòu)域的溶劑暴露區(qū)，由于較大的帶電側(cè)鏈，在該位置取代精氨酸可能導(dǎo)致ALK抑制劑的空間位阻。1171和V1180L是與alectinib有關(guān)的兩個(gè)耐藥突變。旁路途經(jīng)的激活也是第二代ALK抑制劑耐藥的機(jī)制之一，在使用ceritinib和alectinib的患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)了MET擴(kuò)增。與第二代ALK抑制劑耐藥有關(guān)的其他通路包括SRC、MAPK和PI3K，但需要進(jìn)一步研究以闡明它們的機(jī)制。另外兩個(gè)不涉及旁路通路激活的潛在耐藥機(jī)制是P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gP)過(guò)度表達(dá)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。P-gp的過(guò)度表達(dá)對(duì)crizotinib和ceritinib具有耐藥性，而對(duì)alectinib沒(méi)有耐藥性。在一項(xiàng)研究中，上調(diào)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin，NRG1)可通過(guò)激活EGFR家族通路(NRG1-HER3-EGFR軸)，使NCI-H3122細(xì)胞對(duì)ceritinib、alectinib和brigatinib產(chǎn)生耐藥性[20]。

4.3 Brigatinib耐藥機(jī)制對(duì)于上述討論的幾乎所有ALK突變，brigatinib在體外均表現(xiàn)出較高的抑制性和選擇性，其克服了對(duì)其他第一和第二代ALK抑制劑的耐藥性。然而，在brigatinib進(jìn)展的患者中發(fā)現(xiàn)了難治性G1202R耐藥突變，其對(duì)ALK的抑制作用較弱[15,21]。但與crizotinib或任何其他第二代ALK抑制劑相比，brigatinib仍具有更高的活性。

5 未來(lái)發(fā)展方向

5.1 ALK抑制劑序貫治療改善ALK融合基因陽(yáng)性NSCLC患者預(yù)后的一種策略是根據(jù)患者的ALK突變譜，及目前關(guān)于這些突變對(duì)不同ALK抑制劑耐藥性或敏感性的認(rèn)識(shí)，采用第一代、第二代和第三代ALK抑制劑的不同組合進(jìn)行序貫治療。一項(xiàng)招募了73名ALK陽(yáng)性NSCLC患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，使用crizotinib和ceritinib進(jìn)行序貫治療的中位PFS為17.4個(gè)月，而在使用ceritinib之前，單獨(dú)使用crizotinib的中位無(wú)進(jìn)展生存期(Median progression-free survival，mPFS)僅為8.2個(gè)月，該研究結(jié)果顯示了序貫治療的可行性[22]。當(dāng)然，我們期待更多的前瞻性研究結(jié)果為患者提供更有效的治療方案。

5.2 與其他藥物聯(lián)合治療目前正在研究各種形式的聯(lián)合治療，以誘導(dǎo)對(duì)ALK抑制劑耐藥患者產(chǎn)生持久的反應(yīng)。表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)EGFR激活至少有三種機(jī)制可以促進(jìn)肺癌靶向癌激酶融合治療的耐藥，包括針對(duì)ALK的機(jī)制[23]。這表明與單用ALK抑制劑相比，ALK和EGFR的靶向聯(lián)合治療這種特異性耐藥更有效。如前所述，當(dāng)治療EGFR通路過(guò)度活化的ceritinib和alectinib耐藥細(xì)胞時(shí)，ceritinib或alectinib聯(lián)合EGFR抑制劑阿法替尼更有效[20]。熱休克蛋白90(Heat shock protein90，HSP90)是一種重要的分子伴侶，在蛋白質(zhì)的正確折疊和穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。Gnestespib是HSP90抑制劑，與ALK抑制劑聯(lián)合顯示出了良好的抗腫瘤效果。ganetespib克服了多種形式的crizotinib耐藥，包括常見(jiàn)的ALK繼發(fā)性突變。HSP90抑制劑的常見(jiàn)毒性反應(yīng)有腹瀉、惡心、嘔吐、乏力、夜盲癥和視力減退，嚴(yán)重時(shí)需停藥。因此，降低聯(lián)合治療的毒性反應(yīng)是未來(lái)臨床試驗(yàn)中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。免疫治療也是目前研究的熱點(diǎn)，正在進(jìn)行的一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)(NCT02584634)通過(guò)比較avelumab與crizotinib或lorlatinib的聯(lián)合探索晚期NSCLC患者的治療效果[24]。另一項(xiàng)關(guān)于納武單抗(Nivolumab)聯(lián)合crizotinib作為NSCLC患者的一線治療的I/II臨床試驗(yàn)(CheckMate370)也正在開(kāi)展[25]。由于ALK融合基因的檢測(cè)方法和ALK抑制劑的成本較高，無(wú)論是序貫治療或是與其他藥物聯(lián)合，治療的目標(biāo)都是提高患者質(zhì)量調(diào)整壽命年(Quality-adjusted life years，QALYs)，降低治療成本。

6 小結(jié)

在NSCLC中發(fā)現(xiàn)ALK融合基因后，靶向治療藥物應(yīng)運(yùn)而生，同時(shí)，用于指導(dǎo)治療的ALK檢測(cè)也迅速發(fā)展，目前廣泛使用的檢測(cè)方法有IHC、FISH、RT-PCR和NGS。使用ALK抑制劑治療使患者的PFS延長(zhǎng)，癥狀嚴(yán)重程度降低，與化療相比為患者提供了更高的生活質(zhì)量。然而，耐藥成為一個(gè)主要的限制因素。ALK抑制劑的序貫治療及ALK與其他抑制劑的聯(lián)合也不失為一種選擇。但crizotinib等ALK抑制劑價(jià)格昂貴，且聯(lián)合治療加重了毒性反應(yīng)。因此，加深對(duì)耐藥機(jī)制的研究，加快對(duì)新型抗腫瘤藥物的研發(fā)及探索更多形式的治療是改善NSCLC患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。