陳 沫，陳禮峰，周震宇，劉華明，顧炳仁

蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215000

阿魏酸哌嗪是一類非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，是當(dāng)歸、川穹等中藥的有效成分阿魏酸經(jīng)與哌嗪成鹽的化學(xué)合成藥物。作為我國自主研發(fā)的藥物，阿魏酸哌嗪片在臨床上主要用于各類伴有鏡下血尿和高凝狀態(tài)的腎小球疾病，如腎炎、慢性腎炎、腎病綜合癥、早期尿毒癥以及冠心病、腦梗塞及脈管炎等的輔助治療[1，2]。阿魏酸哌嗪片為醫(yī)保乙類藥品，也是《中國藥典》[3]收載品種，臨床應(yīng)用廣泛，療效明確。在目前發(fā)表的文獻(xiàn)中，未見對阿魏酸哌嗪片溶出度研究的文章。在多種不同pH 溶出介質(zhì)中溶出曲線測定不僅是口服固體制劑質(zhì)量評價的重要方法，也為仿制藥一致性評價提供了依據(jù)[4]。

本研究建立了高效液相色譜法對阿魏酸哌嗪片進(jìn)行溶出曲線的測定，考察了4 家生產(chǎn)企業(yè)12批阿魏酸哌嗪片在4 種不同pH 溶出介質(zhì)中的溶出曲線，并采用f2因子進(jìn)行了體外溶出一致性評價，為該制劑內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)劣及生物等效性試驗提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

708-DS 全自動藥物溶出儀 （美國安捷倫公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；ZKT-18F 真空脫氣機(jī) （天大天發(fā)科技有限公司）；XPE105 分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

阿魏酸哌嗪對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號：100834-201302）；阿魏酸哌嗪片樣品（批號：181004、171104、180503，A 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號：180802、180101、190301，B 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號：171105、190207，C 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號：180708，C企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，180 片/瓶；批號：180901、181203，D 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號：180201，D 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，120 片/瓶）。

無水乙酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、冰醋酸均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：1%冰醋酸-甲醇（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測波長：320 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 溶出條件

根據(jù)《中國藥典》和《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]中溶出度試驗方法，分別以pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和水作為溶出介質(zhì)。介質(zhì)體積900 mL，溶出方法：籃法，轉(zhuǎn)速：50 r·min-1；取樣時間：5、10、15、30、45、60 min。采用槳法50 轉(zhuǎn)時，各樣品片掉落溶出杯中不同位置，樣品片周圍溶出介質(zhì)流速可能不同，導(dǎo)致5 min 時RSD 偏大。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取阿魏酸哌嗪對照品55 mg，置100 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取儲備液5 mL，置50 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液 取每批樣品12 片，分別在pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和水4 種介質(zhì)條件下進(jìn)行試驗，在各時間點取溶液用0.45 μm 濾膜濾過，即得。

2.3.3 陰性對照溶液 選取A 企業(yè)樣品進(jìn)行研究，按企業(yè)處方比例配制空白輔料約1 片量，分別加4種溶出介質(zhì)900 mL，超聲溶解，濾過，即得。

2.4 溶出方法學(xué)驗證

2.4.1 專屬性試驗 分別取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。陰性對照溶液對測定無干擾。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液適量，加相應(yīng)溶出介質(zhì)稀釋成濃度為0.2200、1.100、5.500、11.00、22.00、55.00、110.0、220.0 μg·mL-1的溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程及線性范圍見表1。

2.4.3 進(jìn)樣精密度試驗 取“2.4.2”項下各溶出介質(zhì)制備的阿魏酸哌嗪對照品溶液（55 μg·mL-1）進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果RSD 分別為0.38%、0.28%、0.25%、0.08%，表明儀器的精密度良好。

表1 回歸方程與線性范圍

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取4 種溶出介質(zhì)中60 min 時的供試品溶液（55 μg·mL-1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，記錄各峰面積，結(jié)果阿魏酸哌嗪峰面積RSD 均小于1.0%，表明供試品溶液在4種溶出介質(zhì)中室溫放置12 h 穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率試驗 按處方比例，分別精密稱取相當(dāng)于樣品標(biāo)示量50%、75%、100%的阿魏酸哌嗪對照品，稱取相應(yīng)量的A 企業(yè)空白輔料，分別按“2.2”項下方法進(jìn)行溶出試驗，經(jīng)60 min 時，取續(xù)濾液進(jìn)樣，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示RSD%小于2.0%，方法回收率良好。

表2 回收率試驗結(jié)果（n=9）

2.4.6 濾膜吸附性試驗 取4 種溶出介質(zhì)中60min 時的供試品溶液，分別經(jīng)離心和濾膜過濾2、4、8 mL 后進(jìn)行測定，結(jié)果離心后阿魏酸哌嗪峰面積與過濾后峰面積基本一致；濾膜對阿魏酸哌嗪基本無吸附。

2.4.7 管路吸附性 取4 種溶出介質(zhì)中60 min 時的供試品溶液,經(jīng)手動取樣和儀器自動取樣并進(jìn)行測定，兩種取樣結(jié)果測得阿魏酸哌嗪峰面積基本一致，表明儀器管路對阿魏酸哌嗪基本無吸附。

2.5 阿魏酸哌嗪pH-溶解性曲線

按照《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]配制pH 值分別為1.0、1.2、2.0、4.0、5.5、6.0、6.8、7.0、8.0 的溶出介質(zhì)。取阿魏酸哌嗪對照品約50 mg，分別加入以上溶出介質(zhì)各2 mL，超聲處理30 min，置搖床中振蕩1 h，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，用HPLC 法測定溶液中阿魏酸哌嗪的濃度，計算不同pH 下阿魏酸哌嗪的溶解度，并繪制阿魏酸哌嗪的pH-溶解性曲線，見圖2。

2.6 溶出曲線制備

A、B、C、D 企業(yè)生產(chǎn)的4 批阿魏酸哌嗪片（181004、180802、171105、180901） 在4 種不同pH介質(zhì)中的溶出行為（n=12）見圖3。

同一企業(yè)生產(chǎn)的不同批號的阿魏酸哌嗪片在4種不同pH 介質(zhì)中的溶出曲線（n=12）見圖4。

2.7 相似性評價

參照《普通口服固體制劑溶出度試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》，應(yīng)用相似因子f2的模型非依賴方法，來比較溶出曲線相似性。非模型依賴的f2計算公式為：

其中Rt、Tt分別為各時間點參比制劑和供試制劑的溶出度。由于阿魏酸哌嗪片為中國自主研發(fā)的藥物，國外并無同類型產(chǎn)品，故本試驗采用最早生產(chǎn)阿魏酸哌嗪片A 企業(yè)的一個批次作為參比制劑，即批號181004。如果50≤f2≤100，可認(rèn)為溶出曲線相似，普通固體制劑若15 min 內(nèi)的平均溶出量大于85%時，可認(rèn)為溶出曲線相似，不再計算f2值，溶出曲線f2值測定結(jié)果匯總見表3。

2.7.1 pH 1.2 鹽酸溶液 12 批次樣品在60 min 時累計溶出量均低于15%，試驗過程中樣品均出現(xiàn)溶脹、未完全崩解現(xiàn)象，不進(jìn)行f2因子計算。

2.7.2 pH 4.0 醋酸鹽緩沖液 A 企業(yè)的3 批樣品和B 企業(yè)的2 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量均≥85%，其余7 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量均<85%，且f2值均<50。由圖4 可見，各樣品在溶出介質(zhì)pH 4.0 醋酸鹽緩沖液中溶出行為差異較大。

2.7.3 水和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液 3 家企業(yè)的9 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量均≥85%，可認(rèn)為A、B、D企業(yè)的阿魏酸哌嗪片溶出行為相似。C 企業(yè)的3 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量<85%，且C 的3 批次f2值分別為24.0、24.2、25.6，均<50，表明C 企業(yè)與A 企業(yè)樣品溶出行為差異較大。

表3 f2 因子結(jié)果統(tǒng)計表

3 討論

早期的藥品研發(fā)過程不能滿足現(xiàn)行一致性評價要求，作為原研制劑的關(guān)鍵技術(shù)屬性尚不清楚，因此對于此類制劑，進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)量屬性的考察，建立并驗證有適度區(qū)分力的溶出曲線方法，考察產(chǎn)品批內(nèi)、批間溶出曲線差異，對其一致性評價具有非常重要的科學(xué)意義和臨床價值。

所建立的HPLC 法測定阿魏酸哌嗪片溶出度曲線，并對該方法進(jìn)行了驗證，與《中國藥典》紫外-可見分光光度法相比，本方法靈敏度高，專屬性好，準(zhǔn)確度高，可用于阿魏酸哌嗪片的含量測定，有利于對制劑質(zhì)量進(jìn)行評價和控制。

國外藥典并未收載阿魏酸哌嗪片同類型產(chǎn)品，本研究所選擇的參比制劑不是真正意義上的參比制劑，使用f2因子法只是為了評價不同企業(yè)生產(chǎn)的不同批次的阿魏酸哌嗪片是否存在差異。從溶出曲線結(jié)果看出，在pH 1.2 鹽酸的溶出介質(zhì)中所有生產(chǎn)企業(yè)各批次樣品溶出速率均較慢，在60 min 時累計溶出量均低于15%，樣品均出現(xiàn)溶脹、未完全崩解的現(xiàn)象，參考阿魏酸哌嗪的pH-溶出曲線，在pH 1.2鹽酸中溶解度為0.63 mg·mL-1，滿足漏槽條件，且阿魏酸哌嗪片為素片，提示該片存在胃中崩解釋放緩慢問題，可能影響藥物吸收和藥效發(fā)揮。在水和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中各生產(chǎn)企業(yè)各批次產(chǎn)品都無較明顯區(qū)分力。在pH 4.0 醋酸鹽溶出介質(zhì)中除了A 企業(yè)3 批樣品溶出曲線相似，對其他3 家企業(yè)9 批樣品均有較明顯的區(qū)分力，提示不同企業(yè)生產(chǎn)處方工藝方面存在一定差異，企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)處方工藝的篩選優(yōu)化，改進(jìn)提高生產(chǎn)工藝。