李斐斐 唐楠 唐道城 李啟琴

摘要 為了篩選出山丹繼代培養(yǎng)的最佳轉接時間，以利于又快又好的擴繁，以青海6個山丹居群的初代苗為材料，研究繼代后6周內的形態(tài)及芽分化情況。結果表明，在繼代培養(yǎng)6周內，6個居群的芽苗高度、芽分化數在前3周不存在顯著差異，在4～6周居群間的芽苗高度表現(xiàn)為極顯著差異，芽分化數第4周居群間表現(xiàn)極顯著差異，之后各居群間差異不顯著;各居群形成的微型鱗莖直徑及葉面積在前2周不存在顯著差異，3～6周各居群的微型鱗莖直徑及葉面積存在極顯著差異。對各居群繼代培養(yǎng)期間芽苗及微型鱗莖綜合評價表明，在6周內SZ居群長勢最好，其次為Rn居群，DW居群的長勢最差。

關鍵詞 山丹;繼代培養(yǎng);形態(tài)特征;居群

中圖分類號 S682.2+9文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）24-0056-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Subculture Effect of Six Lilium pumilum DC. Populations in Qinghai

LI Feifei，TANG Nan，TANGDaocheng et al （Plateau Flower Research Center of Qinghai University， Xining，Qinghai810016）

Abstract In order to screen out the best transfer time of Lilium pumilum DC. subculture， it is conducive to rapid and good expansion.The primary cultured seedlings of 6 Lilium pumilum DC. populations in Qinghai were used as materials，the changes in the number of morphological and bud differentiation within 6 weeks after subculture were studied.The result showed that within 6 weeks of subculture， there was no significant difference in the height of buds and the number of buds in the six populations during the first 3 weeks.The height of the shoots between the populations within 4-6 weeks was extremely significant.The number of bud differentiation showed extremely significant differences among populations in the fourth week.After that， the differences between the populations were not significant; miniature bulb diameter and leaf area formed by each population did not differ significantly in the first 2 weeks.There was a significant difference in the diameter and leaf area of theminiature bulbs of each population within 3-6 weeks.Comprehensive evaluation of sprouts and miniature bulbs during subculture of each population showed that，SZ population was the best in 6 weeks.The second place was the Rn population.The DW population had the worst growth.

Key words Lilium pumilum;Subculture;Morphological characteristics; Population

山丹（Lilium pumilum DC.）別名細葉百合、山丹花，屬于百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium） 多年生鱗莖類植物[1]。我國擁有豐富的野生山丹種質資源，地理分布范圍廣，是百合屬中分布區(qū)最廣的種，生境條件多樣，也是青海地區(qū)唯一的一種野生百合種，主要分布在海拔2 300～4 000 m[2-4]。山丹百合種球繁殖率低，生長量小，隨著旅游業(yè)和畜牧業(yè)的快速發(fā)展，野生山丹百合的分布空間逐漸變小，人工栽培的山丹百合因生長量小和繁殖率低等原因始終未能形成生產規(guī)模，因此，在較短時間內繁殖出更多更好的優(yōu)質種源，是目前急需解決的技術問題。

百合常規(guī)的繁殖方式繁殖時間較長，易受環(huán)境的影響成活率低，經多代繁殖后病毒不斷積累，種性退化，種球的質量與產量降低[5-6]。利用組織培養(yǎng)技術繁殖時取材方便，不受自然條件的約束，可以大量高品質的進行繁殖，且生育周期短 ，還可以引種栽培、進行種質資源的保護以及保護瀕危植物。陳燦[7]對白芨進行組織培養(yǎng)，成功建立了白芨高效的快繁體系。韓瀛[8]研究了鄂爾多斯半日花各生長階段的適宜培養(yǎng)基種類和激素組合，為半日花物種保護和種質資源保存奠定了一定的基礎。王凱[9]、劉冬云等[10]對山丹組織培養(yǎng)有一定的研究。

百合的組織培養(yǎng)始于20世紀50年代末，Robb[11]采用百合鱗莖成功進行了離體培養(yǎng)。關于百合組織培養(yǎng)的研究較多，何香杉[12]探討了不同蔗糖濃度對百合離體保存的效果，并初步建立了3種切花百合移栽馴化體系。李宏宇等[13]對東方百合西伯利亞品種的鱗片、葉片不同培養(yǎng)基及不同放置位置進行了篩選，建立較穩(wěn)定可靠的東方百合組織培養(yǎng)快繁體系。筆者以青海地區(qū)6個山丹居群資源為研究對象，通過組織培養(yǎng)，比較了各個居群在相同環(huán)境下生長的形態(tài)差異，以期通過形態(tài)差異探討不同居群在繼代培養(yǎng)中的最佳轉接繼代時間，為山丹的遺傳育種、種質資源的保護與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試山丹百合資源于 2014年7月采自青海省互助縣（HZ）、湟中縣上莊鄉(xiāng)（SZ）、民和縣七里寺鄉(xiāng)（QL）、平安縣（PA）、黃南藏族自治州坎布拉（Rn）、同仁縣多哇鄉(xiāng)（DW），采樣點的地理位置見表 1。

1.2 試驗方法

1.2.1 山丹的初代培養(yǎng)。

選擇采自野外的6個山丹百合居群個大色白、肉質肥厚的鱗莖，沖洗表面的泥土，去掉最外2層鱗片，取中間部分，用洗衣粉沖洗干凈，流水沖洗30 min，切成（3～5）mm×（3～5）mm的小鱗片，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3遍，0.1%氯化汞溶液浸泡12 min，再用無菌水沖洗3遍，浸泡于無菌水中備用。

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為MS+0.6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，溫度23 ℃左右，光強1 400～1 800 lx，18 h/d，相對濕度70%～80%。

1.2.2 山丹的繼代培養(yǎng)。

選取初代培養(yǎng)的小鱗莖，切除葉片，每個苗高保持在0.5 mm，并選擇鱗莖直徑為4 mm左右的小鱗莖，每瓶放置3個切好的小鱗莖，在培養(yǎng)基為MS+0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA的配方下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23～25 ℃，光照18 h/d，光強1 400～1 800 lx，相對濕度70%～80%。

1.2.3 山丹各居群形態(tài)學觀測。

繼代接種后觀測記錄植株的苗高（培養(yǎng)基平面到植株最高處的垂直高度）、芽分化情況（肉眼可見的芽的個數）、小鱗莖直徑（鱗莖塊最寬處的直徑）、葉長、葉寬。每7 d觀測一次，共觀測6次。試驗分3個時間段進行3次重復。

1.2.4 山丹百合各居群的綜合評價。對繼代培養(yǎng)物7 d的芽苗高、芽分化數量、微型鱗莖直徑以及葉面積進行由低到高的排序，分別為1、2、3、4、5、6分，若2個居群出現(xiàn)相同分值，則該分值的下一個分值排序輪空。各居群每周的總分值作為判定轉接或出瓶時間，每個居群6周的總分值作為居群繼代分化的差異性評價。

2 結果與分析

2.1 山丹居群繼代培養(yǎng)芽苗高的差異

由表2可知，6個山丹居群植株的芽苗高在前3周內不存在顯著差異，但隨著時間的延長芽苗高不斷增高，第4周時SZ居群的芽苗高極顯著高于QL居群，SZ、PA居群的芽苗高顯著高于DW、HZ與Rn居群，而DW、HZ與Rn居群的苗高不存在顯著差異，第5周時Rn居群的芽苗高顯著高于DW居群，HZ、PA、SZ與QL居群不存在顯著差異，在第6周時SZ居群的芽苗高極顯著高于DW居群，HZ、PA和Rn居群之間不存在顯著差異。

2.2 山丹居群繼代培養(yǎng)物芽分化數的差異

由表3可知，繼代培養(yǎng)3周內6個山丹居群的芽分化個數都不存在顯著差異，繼代培養(yǎng)2周后居群DW、HZ和Rn基本沒有分化，其余居群逐漸開始分化，繼代培養(yǎng)3周后DW和Rn居群還是基本沒有分化，從第4周開始6個山丹居群停止分化，第4周時，居群DW的芽分化個數顯著低于其他居群，與其他居群存在極顯著差異，居群PA和SZ之間的芽分化個數無顯著差異;第5周時，居群DW的芽分化個數最少，居群DW和其余居群存在顯著差異，居群HZ、PA、SZ和Rn之間無顯著差異;第6周時，居群PA與居群SZ、Rn之間不存在顯著差異 ，與居群QL、DW和HZ存在顯著差異。

2.3 山丹居群繼代培養(yǎng)物鱗莖直徑的差異

由表4可知，DW、Rn、PA和SZ居群的鱗莖直徑在1～3周增長趨勢比4～6周快。前2周內各居群的鱗莖直徑都不存在顯著差異;第3周時，SZ居群極顯著高于DW居群，HZ居群顯著高于PA和Rn居群，PA和Rn居群之間不存在顯著差異;第 4周時，SZ居群極顯著高于DW和PA居群，HZ居群顯著高于Rn居群;第5～6周時SZ居群均極顯著高于DW和PA居群。

由于居群QL初代培養(yǎng)的小鱗莖不呈緊密抱合狀態(tài)，十分分散，在接種時，只能接種其鱗片，而非鱗莖塊，因此在鱗莖直徑的差異性比較中僅對另外5個居群（DW、HZ、PA、SZ、Rn）進行比較。

2.4 山丹居群繼代培養(yǎng)物葉面積的差異

由于在記錄數據時，接種后第1周各個居群的植株未長葉，因此從接種后第2周起開始記錄葉長和葉寬。第2周時各個居群之間不存在顯著差異;第3周時，居群SZ與Rn不存在顯著差異，與居群QL存在顯著差異，與DW、HZ、PA存在極顯著差異;第4周時，居群SZ的葉片面積最大，居群DW 葉片面積最小，居群SZ的葉片面積明顯大于居群DW、Rn、QL、HZ、PA，居群SZ與Rn存在顯著差異，與居群DW、HZ、PA、QL存在極顯著差異，居群HZ與PA不存在顯著差異;第6周時，居群SZ與居群Rn不存在顯著差異，與居群DW、QL、HZ、PA 存在極顯著差異（表5）。

以進行轉接，Rn與HZ居群的最佳轉接時間是第5周，PA居群的轉接時間為第4周，QL居群最佳的轉接時間是第2周。DW居群轉接時間不受繼代培養(yǎng)周數的影響。

通過計算各居群6周內的總得分可知（圖2），6周內各居群長勢最好的是SZ居群，其次是Rn居群，長勢最不好的是DW居群。

3 討論

經過6周的繼代培養(yǎng)，6個山丹居群的芽苗高度、芽分化、鱗莖直徑、葉片面積方面均表現(xiàn)出一定的差異，這可能是居群的遺傳差異導致了生長的差異[14]。芽苗高度在前3周不存在顯著差異，在4周后居群間的芽苗高度有極顯著差異，第4周時SZ居群極顯著高于QL居群，第6周時SZ居群極顯著高于DW居群。從增長速率來看，4周后DW和QL居群的芽苗高度比其余居群低。芽分化個數在前3周也不存在顯著差異，第4周居群間有極顯著差異，SZ和PA居群極顯著高于DW居群，第5和6周各居群間差異不顯著。鱗莖直徑在前2周不存在顯著差異，3～6周SZ居群均極顯著高于DW和PA居群，各居群的鱗莖直徑在前3周都隨著時間的延長不斷增長，從第3周開始居群DW、PA、SZ和Rn的鱗莖直徑生長趨于穩(wěn)定，而HZ的鱗莖直徑在3～4周沒有增長，從第4周開始增長。各居群的葉片面積在第2周不存在顯著差異，2～5周SZ和Rn居群的葉片面積極顯著大于DW居群，第6周SZ居群的葉面積極顯著大于DW居群，而Rn居群的葉面積顯著大于DW居群。

各居群的長勢從優(yōu)到差為SZ>Rn>PA>HZ>QL>DW，SZ居群在2周后均可以進行轉接，Rn與HZ居群的最佳轉接時間5周后，PA居群的轉接時間為第4周，QL居群最佳的轉接時間是第2周，DW居群轉接時間不受繼代培養(yǎng)周數的影響。

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