李國強(qiáng)，周 亮，李安國，王潮崗

深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋藻類開發(fā)與應(yīng)用工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060

抗菌肽是一種由生物防御系統(tǒng)產(chǎn)生的對抗外源性病原體的小分子肽類物質(zhì)，是體液免疫中的一種重要因子，具有廣譜的抗菌活性[1]，被認(rèn)為是一種天然抗生素.與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽的長期使用不會(huì)產(chǎn)生耐藥性[2]，可激活生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，具有抗腫瘤、抗病毒和抗寄生蟲[3]等功能，是最有希望成為替代抗生素的新型抗菌藥物.據(jù)報(bào)導(dǎo)，目前已發(fā)現(xiàn)超過2 960種抗菌肽，其中，2 184種來自動(dòng)物[4]，而在對蝦中的抗菌肽主要有：對蝦素(penaeidins)、甲殼肽(crustins)和抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factors, ALFs)等[5-7].對蝦素家族有富含脯氨酸的N端，且在C端含有6個(gè)半胱氨酸殘基，已從凡納濱對蝦(Litopenaeusvannanmei)與白濱對蝦(Litopenaeussetiferus)等多種對蝦中分離出來.ALFs在中國鱟(Tachypleustridentatus)血細(xì)胞中首次被分離出來，這是一種含兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵的堿性蛋白，其氨基末端為焦谷氨酸，含有一個(gè)脂多糖結(jié)構(gòu)域(lipoplysacide binding domain, LBD)[8]，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌活性.crustin是無脊椎動(dòng)物中最大抗菌肽家族之一，富含半胱氨酸.甲殼類中共有4種蛋白類型[9].I型crustin主要存在于蟹和龍蝦等生物，由一個(gè)信號(hào)肽、富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和C末端的單個(gè)乳清酸性蛋白(whey acidic protein, WAP)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成.II型crustin主要存在于對蝦中，除富含半胱氨酸外，在N末端含有一個(gè)富含甘氨酸的區(qū)域.III型crustin也稱為含有單一WAP結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，在WAP結(jié)構(gòu)域前有富含脯氨酸和精氨酸的區(qū)域[10-11].IV型crustin是含有2個(gè)WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白[11].以上4種類型的crustin在斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)均有發(fā)現(xiàn)：屬于I型crustin的蛋白有2種；屬于II型crustin的蛋白至少有10多種[12]，其中，crustinPm1和crustinPm5僅對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出抗菌活性，而crustinPm7革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌具有活性[13-15]；屬于III型crustin的蛋白有3種，對革蘭氏陽性菌有抑制功能，但對革蘭氏陰性菌無效，且是枯草桿菌蛋白酶A的競爭性抑制劑[16]；屬于IV型crustin的蛋白有1種，但未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性[17].

抗菌肽是無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要成分，但其在生物體內(nèi)的含量比較低.可利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)中進(jìn)行大量表達(dá)，研究其抗菌功能.由于抗菌肽對細(xì)菌和真菌等具有抑殺作用，很多抗菌肽的異源表達(dá)并不成功，即使獲得了表達(dá)，也易形成包涵體.此外，原核表達(dá)系統(tǒng)為了便于純化，往往帶有標(biāo)簽，這會(huì)影響蛋白的正確折疊和抗體的制備等.因此，如何使抗菌肽實(shí)現(xiàn)高表達(dá)、高活性且不帶外源標(biāo)簽，是目前抗菌肽表達(dá)及功能研究的難點(diǎn).本研究通過比對轉(zhuǎn)錄組測序及抗菌肽數(shù)據(jù)庫，獲得carcininPm3的基因序列，與類泛素蛋白修飾分子(small ubiquitin-like modifier, SUMO)在大腸桿菌中融合表達(dá)，獲得無外源標(biāo)簽的carcininPm3抗菌肽，為后續(xù)的功能分析及應(yīng)用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

E.coliBL21(DE3)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pSmartI-SUMO載體購于通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司.

1.1.2 主要試劑及酶

主要試劑和酶有：Amp、Kana、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、考馬斯亮藍(lán)、Tris、NaCl和咪唑(imidazole).質(zhì)粒提取試劑盒購自Takara(北京)公司；Direct-loadTMColor Prestain Protein Marker(10～180 kDa, 1 Da =1 u)購自廣州市康潤生物科技有限公司；5× 蛋白上樣緩沖液、Broadford試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 carcininPm3基因的合成和載體的構(gòu)建

將carcininPm3的成熟肽與具有His標(biāo)簽的SUMO蛋白C末端融合，并在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá).carcininPm3的核苷酸序列在兩端具有SacI和XhoI酶切位點(diǎn)，可根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化其密碼子，然后交由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司通過化學(xué)合成方法合成基因，最后通過SacI和XhoI酶切位點(diǎn)將合成的DNA與pSmartI-SUMO載體連接，得到重組質(zhì)粒，命名為pSmartI-SUMO-carcininPm3.

1.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達(dá)載體pSmartI-SUMO-carcininPm3，采用熱激法轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，獲得單克隆菌落.按照以下的步驟進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)：① 挑取陽性單克隆菌落接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃以200 r/min振蕩菌液，培養(yǎng)過夜；② 次日將過夜培養(yǎng)的菌液按體積比1∶100加到新鮮的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃以200 r/min振蕩菌液，培養(yǎng)菌液至光密度D(600)≈0.6，加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L，在加入IPTG誘導(dǎo)前取1 mL菌液作為對照；③ 在37 ℃以200 r/min振蕩菌液，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h；④ 誘導(dǎo)完畢后，取1 mL誘導(dǎo)后的菌液，剩余的菌液以8 000 r/min離心10 min收集菌體，加入平衡緩沖液(50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH=8.0)重懸菌體，超聲破碎菌體40 min(功率為195 W，超聲2 s，停頓4 s)，于4 ℃以10 000 r/min離心30 min后分離出上清與沉淀；⑤ 取誘導(dǎo)前菌液、誘導(dǎo)6 h的菌液、破碎菌液后的上清和破碎菌液后的沉淀，分別加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)電泳檢測蛋白表達(dá)及其可溶性的情況.

1.4 原核表達(dá)條件的優(yōu)化

進(jìn)行原核表達(dá)時(shí)，影響蛋白表達(dá)量的條件主要是誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度，為獲得大量蛋白，需對蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化.時(shí)間梯度設(shè)為0、1.5、3.0、4.5、6.0和7.5 h；IPTG終濃度的梯度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L.按照1.3節(jié)方法進(jìn)行誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況，最終確定表達(dá)的最佳條件.

1.5 carcininPm3蛋白的分離純化

按照1.3節(jié)方法收集菌體，取100 mL培養(yǎng)物的菌體沉淀，加入4 mL 平衡緩沖液(50 mmol/L Tris、200 mmol/L NaCl，pH=8.0)重懸菌體，超聲破碎后收集上清，并用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾.上清液中的His-SUMO-carcininPm3融合蛋白通過鎳柱親和層析進(jìn)行分離純化.先用平衡緩沖液(50 mmol/L Tris, 200 mmol/L NaCl，pH=8.0)平衡柱子，并調(diào)0，待吸收峰穩(wěn)定后上蛋白樣品，待流出峰經(jīng)過，吸收峰下降并穩(wěn)定后用洗脫液(50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，60 mmol/L imidazole, pH=8.0)洗脫未結(jié)合蛋白；然后，換收集液 1(50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，200 mmol/L imidazole，pH=8.0)洗脫并收集樣品；最后，用收集液 2(50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L imidazole，pH=8.0)洗脫并收集樣品.收集好的樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化結(jié)果.

1.6 蛋白濃度的測定

將過柱純化后獲得的融合蛋白溶液裝入透析袋，浸泡在平衡緩沖液(50 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH=8.0)中，于4 ℃透析16 h，以去除蛋白溶液中的咪唑.根據(jù)Bradford試劑盒說明書制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用多功能酶標(biāo)儀測定融合蛋白光密度D(595)，再根據(jù)D(595)的值與標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出融合蛋白濃度，最后將蛋白溶液分裝并進(jìn)行真空干燥，獲得蛋白粉末存于-80 ℃.

1.7 SUMO融合標(biāo)簽的分離

由于SUMO標(biāo)簽相對分子質(zhì)量大，可能影響carcininPm3蛋白功能，所以利用SUMO酶(購自通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司)將SUMO融合標(biāo)簽與carcininPm3蛋白切割分離，獲得不帶標(biāo)簽的目的蛋白carcininPm3.為能完全去除SUMO標(biāo)簽，取相同質(zhì)量的融合蛋白carcininPm3，分別加入不同量的SUMO酶，于4 ℃酶切16 h，SDS-PAGE檢測酶切結(jié)果，最終確定SUMO酶與融合蛋白的最佳切割質(zhì)量比例.

1.8 利用LC-MS鑒定carcininPm3

將SDS-PAGE凝膠電泳得到的carcininPm3蛋白條帶進(jìn)行切膠，并放置于1.5 mL EP離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈，于37 ℃以200 r/min振蕩脫色過夜；用純乙腈使膠體變白變硬，棄上清，加入胰酶酶解，再加入覆蓋液(碳酸氫銨)于37 ℃水浴16 h；經(jīng)胰酶酶解后轉(zhuǎn)至新的1.5 mL EP離心管，加入萃取液(水和無水乙腈按照體積比1∶4混合后，加入總體積0.5%的甲酸)，超聲10 min，離心，再將萃取液真空干燥4 h得到蛋白粉末；用上樣液(水和無水乙腈按照體積比1∶49混合后，再加入總體積0.5%的甲酸)溶解蛋白粉末，渦旋振蕩后13 000g室溫下離心15 min，最后利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatograph mass spectrometer, LC-MS)鑒定carcininPm3蛋白.

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得carcininPm3原核表達(dá)載體

carcininPm3成熟肽的氨基酸序列為：APQSSV LLPTPVPSCSRWCHHDVDGYLYCCQEEQGVGAHSGK CPDTPIQPHEQNILDTKGGGALHCERDGDCAKNQKC CYTKFRQQRICRNV，它是一類新型的對蝦抗菌肽，僅與南美白對蝦(Penaeusvannamei)有較高同源性(88%)，與日本囊對蝦(Penaeusjaponicus)等物種的同源性都低于45%.carcininPm3蛋白的分子質(zhì)量為10.2 kDa，等電點(diǎn)(isoelectric point, pI)值為7.09.根據(jù)大腸桿菌密碼子合成carcininPm3成熟肽的基因序列，最終連接到pSmartI-SUMO載體的SacI和XhoI上，與載體上的SUMO的蛋白C末端融合，獲得pSmartI-SUMO-carcininPm3表達(dá)載體(圖1).

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.2 carcininPm3的表達(dá)及可溶性檢測

將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，并對carcininPm3的可溶性進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2.由圖2可見，誘導(dǎo)6 h后融合蛋白carcininPm3得以正常表達(dá)，分子質(zhì)量約為25 kDa，并且存在于上清中，表明融合蛋白carcininPm3是可溶性蛋白.

圖2 carcininPm3的原核表達(dá)及可溶性分析

2.3 獲得carcininPm3最優(yōu)表達(dá)條件

圖3 carcininPm3原核表達(dá)的時(shí)間優(yōu)化

圖3為carcininPm3原核表達(dá)及可溶性分析結(jié)果.由圖3可見，在1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，融合蛋白carcininPm3的表達(dá)量逐漸增大，6 h及之后的表達(dá)量接近.圖4的電泳結(jié)果顯示，在不同終濃度IPTG條件下誘導(dǎo)6 h，0.2、0.8和1.0 mmol/L誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)量相差不大，又因IPTG具有毒性，會(huì)危害表達(dá)宿主，所以選擇IPTG終濃度為0.2 mmol/L.因此，可確定融合蛋白carcininPm3的在IPTG終濃度為0.2 mmol/L條件下誘導(dǎo)6 h表達(dá)量最大.

圖4 carcininPm3原核表達(dá)的IPTG濃度優(yōu)化

2.4 carcininPm3的分離純化

將重組菌破碎后的上清先過濾去除雜質(zhì)，再上親和層析柱進(jìn)行純化，經(jīng)過雜蛋白洗脫、目的蛋白收集、透析和SDS-PAGE電泳檢測等步驟獲得目的蛋白.由圖5可見，收集到的融合蛋白在25 kDa附近有一清晰條帶，說明用200 mmol/L和500 mmol/L咪唑均能收集到目的蛋白.

圖5 carcininPm3蛋白的分離純化

2.5 融合蛋白carcininPm3濃度測定

用Bradford法對純化和透析后的融合蛋白carcininPm3進(jìn)行質(zhì)量濃度測定，測得質(zhì)量濃度為195 μg/mL.隨后將蛋白溶液分裝成10 mL/管，通過冷凍真空干燥獲得蛋白粉末，于-80 ℃存儲(chǔ)備用.

2.6 tag-free 抗菌肽的獲得

SUMO蛋白酶是一種具有較高活性的半胱氨酸蛋白酶，僅識(shí)別SUMO蛋白的3級(jí)結(jié)構(gòu).在雙Gly殘基C端精確切割，能高效且特異性地將SUMO蛋白從重組蛋白上切割下來，從而獲得目的蛋白，圖6(a)為SUMO蛋白酶酶切示意圖.

取1管融合蛋白carcininPm3凍干粉，加入超純水，溶解至質(zhì)量濃度為500 μg/mL.取5個(gè)1.5 mL離心管，分別標(biāo)號(hào)1、2、3、4和5，每個(gè)EP管都加入50 μg carcininPm3蛋白，然后分別加入0.5、1.0、1.5和2.0 U(1 U=16.67 nmol/s=16.67 nkatal)的SUMO酶，于4 ℃酶切16 h.圖6(b)為切除SUMO的蛋白電泳圖.結(jié)果顯示，50 μg帶有SUMO標(biāo)簽的融合蛋白只需要0.5 U的SUMO酶就能除去SUMO標(biāo)簽.經(jīng)過SUMO酶切割，獲得去除SUMO蛋白的抗菌肽，該抗菌肽是tag-free多肽，無外源氨基酸，不影響多肽的正確折疊，分子質(zhì)量為10.2 kDa，符合預(yù)期.最終，確定1 U SUMO酶能有效切割100 μg融合蛋白.

圖6 SUMO融合標(biāo)簽的分離

2.7 確認(rèn)carcininPm3蛋白的表達(dá)

圖7 carcininPm3蛋白的質(zhì)譜鑒定

通過LC-MS鑒定目的蛋白，利用Mascot軟件與已知carcininPm3 的氨基酸序列進(jìn)行比對.由圖7可見，共檢測到兩條肽段，氨基酸序列覆蓋率達(dá)到36%，方框里是質(zhì)譜鑒定到的氨基酸，檢測到的氨基酸序列是目的蛋白N端的17個(gè)氨基酸和中間肽段的17個(gè)氨基酸，表明原核表達(dá)獲得了融合蛋白，成功通過SUMO酶切除標(biāo)簽，獲得沒有外源氨基酸的carcininPm3蛋白.

3 討 論

如今抗生素濫用日趨嚴(yán)重，已產(chǎn)生了越來越多的耐藥性菌株，嚴(yán)重威脅人類健康[18].綠色、環(huán)保的抗菌肽是替代抗生素的最佳選擇，在養(yǎng)殖業(yè)尤其是水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要的開發(fā)潛力.然而，天然的抗菌肽廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，含量少且提取難度大.雖然可通過化學(xué)合成抗菌肽，但步驟復(fù)雜且成本昂貴.所以，利用基因工程技術(shù)獲得抗菌肽是最佳選擇，它成本低廉、操作簡便且易于規(guī)?；a(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景[19-20].

抗菌肽最成功的表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng).但是，表達(dá)抗菌肽往往對其本身產(chǎn)生毒性且會(huì)將其殺死[21]，導(dǎo)致表達(dá)失敗.大腸桿菌表達(dá)量大，且易形成包涵體，需通過復(fù)雜的復(fù)性過程才能獲得有活性蛋白[22].因此，采取與可溶性高的蛋白一起融合表達(dá)，更容易獲得高活性的蛋白.作為蛋白融合表達(dá)的標(biāo)簽有很多，SUMO因其可作為分子伴侶，高重組蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)蛋白的正確折疊，且其分子量小，方便切割，且不影響多肽序列和活性，被廣泛用于融合蛋白的表達(dá)[23].抗菌肽的異源表達(dá)往往帶有各種標(biāo)簽(表1)，能促進(jìn)可溶表達(dá)或方便純化[24-26]，但也會(huì)影響抗菌肽的正確折疊，不利于抗體的制備，影響抗菌活性等.抗菌肽一般僅有15～50個(gè)氨基酸，幾個(gè)外源氨基酸的存在也可能影響其功能[27].因此，獲得無外源氨基酸的“純凈”抗菌肽對其功能研究意義重大.本研究通過利用SUMO酶切除了帶有組氨酸標(biāo)簽的SUMO蛋白，獲得了無外源氨基酸的抗菌肽.該技術(shù)既能實(shí)現(xiàn)目的蛋白的高表達(dá)，又能最終獲得“純凈”的抗菌肽，可為進(jìn)一步研究該抗菌肽的功能提供可靠的活性蛋白.

表1 非tag-free抗菌肽表達(dá)的分析

抗菌肽富含疏水性氨基酸，原核表達(dá)往往容易形成包涵體[28]，本研究通過優(yōu)化表達(dá)條件獲得了可溶性蛋白.然而，無論是融合表達(dá)的抗菌肽還是切除融合標(biāo)簽的抗菌肽，均未能對金黃葡萄球菌和溶藻弧菌等產(chǎn)生顯著抑殺效果，僅對副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌等有一定的抑制作用.抗菌肽往往具有α-螺旋和β-折疊，α-螺旋富于疏水性的C端往往插入細(xì)胞膜中，β-折疊則需要二硫鍵來維系其穩(wěn)定性.影響抗菌肽抗菌活性的主要因素包括疏水性、兩親性、螺旋度和正電荷數(shù)等[29].雖然原核表達(dá)系統(tǒng)得到的蛋白量大，但較難得到正確折疊的產(chǎn)物，因此也能影響蛋白活性.下一步將利用本實(shí)驗(yàn)室建立的萊茵衣藻表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)抗菌肽，有助于蛋白形成正確的結(jié)構(gòu)，以獲得高活性的抗菌肽.

結(jié) 語

本研究利用SUMO融合表達(dá)技術(shù)，在E.coli成功表達(dá)了源于斑節(jié)對蝦的抗菌肽carcininPm3，經(jīng)過鎳柱親和層析純化獲得大量且純度較高的重組蛋白，通過SUMO酶酶切和分離后，可獲得高純度的tag-free抗菌肽分子，為carcininPm3的功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).