須周恒，朱營(yíng)利，孫孟菲，魏志遠(yuǎn)，潘佳琪，潘旭斌，陳建歡

1)江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2)江南大學(xué)附屬醫(yī)院(無(wú)錫市第四人民醫(yī)院)，江蘇無(wú)錫214062

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，病變表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元退行性死亡，以引起紋狀體多巴胺含量顯著減少，繼而導(dǎo)致肌張力異常.主要癥狀表現(xiàn)為以靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙為主的運(yùn)動(dòng)異常和以抑郁、便秘和睡眠障礙為主的非運(yùn)動(dòng)癥狀[1].紋狀體由豆?fàn)詈伺c尾狀核組成，是基底神經(jīng)節(jié)重要的組成部分.豆?fàn)詈擞缮n白球與殼核組成.紋狀體中尾狀核、殼核、蒼白球與丘腦底核、黑質(zhì)在結(jié)構(gòu)與功能上是緊密相聯(lián)系的，其中蒼白球是纖維聯(lián)系的中心.基底神經(jīng)節(jié)有重要的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)功能，它與隨意運(yùn)動(dòng)的產(chǎn)生和穩(wěn)定、肌緊張的調(diào)節(jié)和本體感受傳入沖動(dòng)信息的處理都有關(guān)系.紋狀體因其重要功能在PD病理過(guò)程中扮演重要角色.

視網(wǎng)膜常被認(rèn)為是相對(duì)獨(dú)立于大腦的神經(jīng)系統(tǒng).但視網(wǎng)膜和視神經(jīng)與大腦有著相同的胚胎起源，且有類似的血管形成、自我調(diào)節(jié)血流和血液-組織屏障功能的模式.作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的延伸，視網(wǎng)膜具有的血-眼屏障(blood-retinal barrier, BRB)，其在結(jié)構(gòu)上類似于血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的組分和機(jī)制，具有特定的免疫豁免權(quán).近年來(lái)，許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病被發(fā)現(xiàn)常伴有視覺系統(tǒng)的受累[2-5].RAMIREZ[6]指出，視網(wǎng)膜病變可以是某些神經(jīng)退行性疾病，如PD和阿爾茲海默癥的一種臨床表型，有可能作為早期診斷的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo).視覺幻覺(visual hallucination, VH)是PD的一個(gè)特定癥狀，且PD患者中多見視網(wǎng)膜多巴胺含量下降和中央凹視力功能障礙[7].而來(lái)自中心和外周途徑的視覺信息處理缺陷被認(rèn)為是PD中VH的病理生理學(xué)機(jī)制[8].但是，PD中視網(wǎng)膜受累的分子機(jī)制目前仍然不明確.

許多基因被證明與PD相關(guān)，其中，α-突觸核蛋白(α-synuclein, SNCA)被認(rèn)為參與多巴胺釋放和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白tau的纖維化，并通過(guò)抑制p53表達(dá)和促凋亡基因的反式激活導(dǎo)致非多巴胺能神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)表型，導(dǎo)致caspase-3活化減少[23]，其突變常常引起PD 的發(fā)生.

比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)，是研究比較不同生物學(xué)組織或樣本之間的細(xì)胞/組織在轉(zhuǎn)錄組水平的異同點(diǎn).轉(zhuǎn)錄組學(xué)被廣泛應(yīng)用于包括PD在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中[9-13].但到目前為止，尚未見對(duì)視網(wǎng)膜與腦組織的基因表達(dá)譜差異進(jìn)行比較，以及挖掘其與PD相關(guān)生物學(xué)意義的有關(guān)報(bào)道.本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析的方法對(duì)正常小鼠視網(wǎng)膜及紋狀體內(nèi)表達(dá)差異的基因進(jìn)行了分析，對(duì)PD與視網(wǎng)膜改變關(guān)系的重要分子基礎(chǔ)進(jìn)行探討.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物組織的采集

實(shí)驗(yàn)采用3只12周齡雄性C57/BL6小鼠，獲得了江南大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的許可，采用吸入式麻醉劑異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后，通過(guò)心臟灌注法對(duì)小鼠處死(小鼠的處死及組織取材方法請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼查看)，針對(duì)紋狀體和左眼視網(wǎng)膜進(jìn)行組織取材料，新鮮組織離體后迅速切成小塊并置于Trizol溶液中，待組織塊完全溶解后直接進(jìn)行總核糖核酸(ribonucleicacid, RNA)的提取.將3個(gè)視網(wǎng)膜樣本分別編號(hào)為R1、R2和R3，3個(gè)紋狀體樣本分別編號(hào)為S1、S2和S3.

1.2 組織總RNA的提取

利用酚-氯仿法對(duì)所采集的小鼠的紋狀體和視網(wǎng)膜組織進(jìn)行總RNA的提取.

1.3 RNA測(cè)序

所提取的總RNA使用質(zhì)量濃度為10 g/L的瓊脂糖電泳進(jìn)行降解與污染的檢測(cè)，并用kaiaoK5500?分光光度計(jì)測(cè)純度.RNA的完整性和濃度用RNA Nano 6000 assay試劑盒在Bioanalyzer 2100上進(jìn)行測(cè)定.按試劑盒說(shuō)明書，使用NEBNext?UltraTM Directional RNA library Prep kit以核糖體RNA減除法構(gòu)建文庫(kù)，并使用Qubit?RNA assay kit和 Qubit?2.0進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢.所得文庫(kù)在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)上使用150堿基對(duì)(base pair, bp)進(jìn)行雙端測(cè)序.每個(gè)樣本的測(cè)序量均不低于12 Gbase.

1.4 讀段比較及差異表達(dá)基因的分析

所得讀段使用Fastqc進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估.將評(píng)估合格讀段比較到小鼠的全基因組序列(UCSC版本mm10)上.基因的表達(dá)分析使用FeatureCounts進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，用Bioconductor 的edgeR語(yǔ)言包進(jìn)行差異表達(dá)基因 (differentially expressed gene, DEG)分析.為保證得到高度可信的DEG，差異倍數(shù)(flod change, FC)的對(duì)數(shù)值(lb FC)[2]大于2，較正后的假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)小于0.05的基因，認(rèn)為是帶分析的候選DEG.

1.5 差異表達(dá)基因的組成分析

利用R統(tǒng)計(jì)語(yǔ)言的Bioconducter軟件包pheatmap 繪制DEG的熱圖.利用DEG數(shù)據(jù)和ggplot2軟件包中的autoplot函數(shù)繪制主成分分析圖.

1.6 差異表達(dá)基因的功能及通路富集分析

利用DAVID (版本6.8)生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://david.ncifcrf.gov)對(duì)紋狀體和視網(wǎng)膜組織的DEG進(jìn)行功能富集(gene ontology, GO)和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)信號(hào)通路富集分析[14-15].

1.7 基因網(wǎng)絡(luò)圖分析

利用cytoscape(版本3.7.1)中的STRING軟件包(https://string-db.org)對(duì)相關(guān)的DEG進(jìn)行基因間相互作用分析，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠紋狀體與視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)比較

對(duì)兩組小鼠組織中的DEG分析.結(jié)果表明，有2 478個(gè)基因出現(xiàn)了表達(dá)差異(FDR<0.05，lb FC>2或lb FC<-2).其中，899個(gè)基因在紋狀體中相對(duì)于視網(wǎng)膜呈現(xiàn)低表達(dá)，有1 579個(gè)基因在紋狀體中相對(duì)于視網(wǎng)膜呈現(xiàn)高表達(dá)，由此構(gòu)建紋狀體-視網(wǎng)膜基因差異表達(dá)熱圖如圖1(a).完整視網(wǎng)膜及紋狀體間差異表達(dá)基因的表達(dá)差異熱圖和數(shù)據(jù)請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼查看圖S1和表S1.由圖1和表S1可見，紋狀體與視網(wǎng)膜的基因表達(dá)譜有著較大的差別，而主成分分析結(jié)果也可以看出在組內(nèi)差異不大的情況下，兩組樣品可明顯地聚為兩類.由圖1(b)可見，DEG主成分分析中的PC1對(duì)結(jié)果的解釋度達(dá)到65.9%.

2.2 小鼠腦紋狀體與視網(wǎng)膜差異表達(dá)基因的GO分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分析紋狀體-視網(wǎng)膜差異表達(dá)的基因，分別對(duì)紋狀體內(nèi)顯著高表達(dá)及低表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析，顯示紋狀體內(nèi)高表達(dá)的基因參與的生物過(guò)程(biological process, BP)顯著性最強(qiáng)的7個(gè)聚類(term)分別為：細(xì)胞通訊、信號(hào)通路、定位、突觸信號(hào)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨突觸信號(hào)傳導(dǎo)和化學(xué)突觸傳遞等.參與的細(xì)胞組成(cell component, CC)顯著性最強(qiáng)的7個(gè)term分別為：細(xì)胞外周、膜、質(zhì)膜、膜部分、神經(jīng)元部分、質(zhì)膜部分和膜的內(nèi)在組成部分.參與的分子功能(molecular function, MF)分析顯著性最強(qiáng)的7個(gè)term分別為：蛋白質(zhì)結(jié)合、信號(hào)傳感器活動(dòng)、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、無(wú)機(jī)分子實(shí)體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、分子功能調(diào)節(jié)劑和跨膜信號(hào)傳導(dǎo)受體活性，見圖2.完整紋狀體高表達(dá)基因的GO分析結(jié)果請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼見表S2.而視網(wǎng)膜內(nèi)高表達(dá)基因的BP term顯著性前7名分別為：核酸代謝過(guò)程、RNA代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)RNA代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)含核堿基的化合物代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)基因表達(dá)、含核堿基的化合物代謝過(guò)程和RNA生物合成過(guò)程.顯著性前7位的CC term則為：核、核質(zhì)、核腔、核部分、核質(zhì)部分、感光細(xì)胞纖毛和感光器外段.MF前7位的term分別為：DNA結(jié)合、核酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合，以及雙鏈DNA結(jié)合和調(diào)節(jié)區(qū)核酸結(jié)合，見圖3.完整視網(wǎng)膜高表達(dá)基因的GO分析結(jié)果請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼見表S3.紋狀體內(nèi)更傾向于膜表面信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的高表達(dá)，而在視網(wǎng)膜內(nèi)，則是與其功能有關(guān)的視覺感受器相關(guān)基因表達(dá)更為活躍.

2.3 小鼠腦紋狀體與視網(wǎng)膜差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

將紋狀體與視網(wǎng)膜差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，紋狀體內(nèi)高表達(dá)的基因主要富集在核糖體、阿爾茨海默病、氧化磷酸化、帕金森綜合癥、鈣信號(hào)通路、亨廷頓病及神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路上，見圖4.完整紋狀體高表達(dá)KEGG分析結(jié)果請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼見表S4.而視網(wǎng)膜高表達(dá)的基因基因富集通路主要有光轉(zhuǎn)換、RNA降解、剪接、錯(cuò)配修復(fù)、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、維生素消化吸收和細(xì)胞周期等，見圖5.(完整視網(wǎng)膜內(nèi)高表達(dá)基因KEGG分析結(jié)果請(qǐng)掃描論文末頁(yè)右下角二維碼見表S5).KEGG通路分析結(jié)果與觀察到的GO分析的結(jié)果相互印證.

圖1 小鼠腦紋狀體與視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄組水平的差異表達(dá)熱圖

圖2 小鼠腦紋狀體比對(duì)視網(wǎng)膜高表達(dá)差異基因的GO分析

圖3 小鼠腦紋狀體比對(duì)視網(wǎng)膜低表達(dá)差異基因的功能富集分析

2.4 PD通路相關(guān)基因在紋狀體和視網(wǎng)膜中的表達(dá)

因小鼠腦紋狀體高表達(dá)基因的KEGG數(shù)據(jù)分析顯示了這些基因明顯地在帕金森病通路上富集，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的基因互作數(shù)據(jù)，對(duì)鼠紋狀體在該通路中高表達(dá)的差異基因構(gòu)建了基因互作網(wǎng)絡(luò)，見圖6.同時(shí)，針對(duì)所有PD通路基因在正常小鼠腦紋狀體和視網(wǎng)膜兩種組織中的表達(dá)情況進(jìn)行比較.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有129個(gè)PD通路基因被檢測(cè)到有不同程度的表達(dá)，其中，有12個(gè)基因|lb FC|>2，11個(gè)在紋狀體中高表達(dá)，包括：adenosine A2a receptor (Adora2a)、adenylate cyclase 5 (Adcy5)、dopamine receptor D2 (Drd2)、guanine nucleotide binding protein alpha inhibiting 1 (Gnai1)、guanine nucleotide binding protein subunit alpha L (Gnal)、leucine-rich repeat kinase 2 (Lrrk2)、septin 5 (Sept5)、synuclein alpha interacting protein (Sncaip)、synuclein alpha (Snca)、ubiquinol-cytochrome c reductase、complex III subunit XI (Uqcr11)和ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1(Uchl1).有意思的是，另一個(gè)差異基因cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2 (Cox4i2)卻是在視網(wǎng)膜高表達(dá)，見圖7.盡管有該部分基因存在顯著表達(dá)差異，兩種組織表達(dá)的PD通路中的其余117個(gè)基因表達(dá)水平卻比較接近，呈現(xiàn)較為相似的表達(dá)模式.

圖4 小鼠腦紋狀體比對(duì)視網(wǎng)膜高表達(dá)差異基因的KEGG通路分析

圖5 小鼠腦紋狀體比對(duì)視網(wǎng)膜低表達(dá)差異基因的KEGG通路分析

圖6 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的小鼠腦紋狀體相比于視網(wǎng)膜高表達(dá)的帕金森病通路的基因互作網(wǎng)絡(luò)

圖7 在小鼠腦紋狀體和視網(wǎng)膜中帕金森通路基因的差異表達(dá)比較

3 討 論

帕金森病是一種復(fù)雜的多因素疾病，其致病原因包括基因突變、年齡老化、腦外傷和環(huán)境因素等[6]，但確切的致病機(jī)理仍不清楚.帕金森患者常伴有視網(wǎng)膜的受累，后者可呈早期臨床表癥，可能與多巴胺能神經(jīng)元的死亡直接或間接地對(duì)視網(wǎng)膜產(chǎn)生影響有關(guān).類似的大腦對(duì)視網(wǎng)膜的影響可能在多種疾病中存在，例如阿爾茲海默癥患者的視網(wǎng)膜功能改變已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)，并被認(rèn)為可應(yīng)用于該病的早期檢測(cè)[16].而根據(jù)KHOO等[17]的研究，PD患者獨(dú)有的VH 改變存在于22%的PD病人中，因此視網(wǎng)膜的基因表達(dá)的改變有可能作為PD的早期生物標(biāo)記物.本研究通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)分析的方法，對(duì)正常小鼠的紋狀體和視網(wǎng)膜的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)了兩者在基因表達(dá)、功能和通路上的異同.同時(shí)，也揭示了PD通路基因在兩者中表達(dá)的情況，對(duì)PD與視網(wǎng)膜改變關(guān)系的重要分子基礎(chǔ)提供參考.

視網(wǎng)膜是由腦的一部分延伸發(fā)育而來(lái).作為視覺器官眼的核心組成部分，其功能上有相當(dāng)程度的特化.本研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較好地驗(yàn)證了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)紋狀體和視網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)有明顯差異.其中，基因功能富集的結(jié)果顯示，在紋狀體中表現(xiàn)為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的高表達(dá)，這可能是紋狀體作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)結(jié)構(gòu)之一的功能所決定.而在視網(wǎng)膜中表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄和視覺感受器相關(guān)基因的高表達(dá)，這可能與視網(wǎng)膜特殊的光感受與傳導(dǎo)的功能有關(guān)聯(lián).這些基因中有部分，如Rhodopsin和RP1等，也是遺傳性視網(wǎng)膜疾病的重要致病基因[18-19].這說(shuō)明本研究方法能較好地將特異性表達(dá)的基因鑒定出來(lái).在KEGG通路分析中，小鼠腦紋狀體高表達(dá)的基因則富集到了一些神經(jīng)疾病的通路，包括PD、阿爾茨海默病和亨廷頓病等重要的神經(jīng)退行性疾病.而視網(wǎng)膜的基因則顯示了剪接體等轉(zhuǎn)錄相關(guān)通路的富集，這可能與視網(wǎng)膜高度活躍的RNA加工和剪接有關(guān)[20-22].在遺傳性視網(wǎng)膜疾病的已知致病基因中，有一部分已明確與剪接體有關(guān).這也從側(cè)面反映了所篩選的DEG有著較好的代表性.

PD疾病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是本研究的重點(diǎn)，我們對(duì)該通路在正常小鼠紋狀體和視網(wǎng)膜的差異基因表達(dá)譜情況進(jìn)行了較深入的生物信息學(xué)分析，試圖探索PD疾病發(fā)病的分子基礎(chǔ).研究發(fā)現(xiàn)，雖然紋狀體和視網(wǎng)膜的PD信號(hào)通路基因均有一定程度的表達(dá)，但在兩種組織上有差異表達(dá)的129個(gè)已檢測(cè)到的基因中，只有12個(gè)是在PD信號(hào)通路上，不到10%(即|lb FC|≥2)，而絕大多數(shù)(117個(gè))PD通路基因是|lb FC|<2的，與紋狀體呈現(xiàn)了相近的表達(dá)水平.這部分基因的顯著改變，提示它們可能是PD患者視網(wǎng)膜病理性改變的關(guān)鍵分子基礎(chǔ).在|lb FC|≥2的基因中，包括了重要的SNCA 和它的相互作用蛋白(α-synuclein-interacting protein, Sncaip)，這從一定程度上解釋了為什么紋狀體可能對(duì)Snca的改變更加敏感.此外，電子傳遞鏈復(fù)合物Cox家族中的Cox4有兩個(gè)亞基，Cox4i1及Cox4i2，后者是線粒體電子傳遞鏈的組成成分，也是PD通路的成分.而在小鼠視網(wǎng)膜中，僅Cox4i2基因的表達(dá)量高于在紋狀體中的.另外，已知PD發(fā)病涉及毒素影響，因神經(jīng)毒素在體內(nèi)的活性形態(tài)MPP+是魚藤酮等環(huán)境毒素的主要攻擊目標(biāo)，目前已成為PD動(dòng)物造模研究的金標(biāo)準(zhǔn)，因此，本研究提出一個(gè)新的研究思路：MPTP這類毒性物質(zhì)誘導(dǎo)的帕金森病模型可能用于PD視網(wǎng)膜的受累的分子機(jī)制研究.

結(jié) 語(yǔ)

本研究利用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)分析，對(duì)比分析了正常小鼠的紋狀體與視網(wǎng)膜的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)兩者在基因表達(dá)、功能和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上存在許多明顯差異，證實(shí)了基因表達(dá)的差異在組織器官的功能特異性方面起到重要作用.同時(shí)，通過(guò)對(duì)與疾病相關(guān)的分析發(fā)現(xiàn)，PD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的多個(gè)基因在紋狀體和視網(wǎng)膜也有著不同程度的表達(dá)，存在較高程度的相似性，可能是PD在紋狀體與視網(wǎng)膜的共同分子發(fā)病基礎(chǔ)，可為進(jìn)一步研究PD與視網(wǎng)膜的病變關(guān)系提供參考.