仝 申，劉鴻吉，王 科

深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，教育部光電子器件與系統(tǒng)/廣東省重點實驗室，廣東深圳518060

神經(jīng)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，具有感受刺激和傳導(dǎo)興奮的功能，大腦通過神經(jīng)細胞實現(xiàn)信息的存儲和傳遞.多光子顯微成像(multi-photon microscopy, MPM)作為一種非線性光學(xué)成像技術(shù)[1]，廣泛用于活體小鼠腦部神經(jīng)細胞的形態(tài)和功能研究[2-8]，并且為活體生物的病理學(xué)[5, 9](如阿爾茲海默癥)和活體生物神經(jīng)細胞的鈣動力學(xué)[10-11]研究提供寶貴的觀測工具.HORTON等[12-14]演示的1 700 nm波段三光子顯微成像技術(shù)同時支持三次諧波(third-harmonic generation, THG)和三光子激發(fā)熒光(three-photon excited fluorescence, 3PEF)成像兩種成像模態(tài)，均為神經(jīng)細胞的形態(tài)信息和結(jié)構(gòu)信息獲取提供先進的成像方法.

1 700 nm波段三光子顯微成像可以進行光學(xué)切片(焦點處采集信號，避免焦點外的熒光標記漂白)[15]，因此，可實現(xiàn)普通小鼠皮層到白質(zhì)的完整三維成像.激發(fā)光波長越長(近紅外)，在高度散射的腦組織內(nèi)散射越小，到達焦點處的激發(fā)光信號越強，從而獲得更大的成像深度.與之相比，單光子熒光成像需要采用短波長(可見光)激發(fā)，受組織散射影響大，無法獲得大的成像深度.此外，相比于其他成像技術(shù)，如共聚焦顯微成像技術(shù)[16]、光聲成像技術(shù)[17]、相干層析成像技術(shù)[18]以及核磁共振成像技術(shù)[19]等，三光子成像具有亞微米量級的分辨能力和毫米量級的深層組織穿透能力，在普通小鼠腦成像方面具有獨特的應(yīng)用優(yōu)勢.

三光子顯微成像中的三次諧波可以匹配腦組織細胞水平的特定幾何結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)含量，通過部分相位匹配[7]，實現(xiàn)普通小鼠腦組織無標記成像[12]，避免熒光成像時染料可能會對細胞產(chǎn)生毒性等問題.三光子顯微成像作為一種可視化手段，特別適合普通小鼠腦組織的深層成像[13].然而在普通小鼠腦成像中，白質(zhì)以下由于受到腦組織散射和水吸收的影響，無法實現(xiàn)普通小鼠海馬體三次諧波成像.為此，本文結(jié)合腦部注射技術(shù)同步研究普通小鼠急性腦切片(在小鼠死后馬上進行切片)[20]海馬體神經(jīng)細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu).腦部注射腺相關(guān)病毒(AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE)，在特定啟動子控制下，實現(xiàn)普通小鼠大腦中星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞及神經(jīng)細胞的長期、穩(wěn)定表達.

腦部注射技術(shù)是活體生物腦科學(xué)研究的一種重要手段，已有研究多集中在通過共聚焦顯微鏡觀察腦片中腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)病毒標記細胞的成像上，對于普通小鼠腦片在1 700 nm波段三光子顯微成像的研究較少.本研究利用腦部注射AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE病毒，結(jié)合1 700 nm波段的三光子顯微成像技術(shù)，實現(xiàn)普通小鼠的腦片灰質(zhì)、海馬體神經(jīng)細胞三光子熒光成像，及腦片的灰質(zhì)、白質(zhì)和海馬體的三次諧波成像，討論三光子熒光成像和三次諧波成像的相互關(guān)系.本研究提出的多光子顯微成像技術(shù)為腦科學(xué)研究提供一種有效的成像方法.

1 實驗裝置和方法

1.1 成像實驗裝置圖

成像的實驗裝置如圖1.重復(fù)頻率為1 MHz、脈寬為500 fs及輸出波長為1 550 nm的光纖激光器(FLCPA-02CSZU, Calmar Laser)作為泵浦激光器，其輸出光經(jīng)過聚焦透鏡(AC254-100-C-ML, Thorlabs)后，被耦合進入長度為44 cm、纖芯直徑為100 μm的棒狀光子晶體光纖(PC rod, SC-1500/100-Si-ROD, NKT Photonics)中，通過孤子自頻移效應(yīng)產(chǎn)生峰值波長為1 665 nm的高能孤子.光纖輸出端通過透鏡(AC254-125-ML, Thorlabs)準直.使用1 635 nm長波通濾光片(1635lpf, Omega Optical)得到干凈的1 665 nm孤子.隨后激發(fā)光經(jīng)過掃描振鏡反射后，經(jīng)過C-coating掃描透鏡(AC254-040-C-ML, Thorlabs)和套筒透鏡實現(xiàn)1∶4的擴束.通過965 nm雙色鏡(T965lpxxrxt-UF1, Chorma)進入工作距離為2 mm、數(shù)值孔徑為1.05的定制鍍膜物鏡(XLPLN25XWMP2-SP1700, Olympus)，該物鏡在1 700 nm波段具有高透過率(～76%)，將激發(fā)光聚焦到樣品上產(chǎn)生三光子信號，三光子信號經(jīng)定制鍍膜物鏡收集后通過雙色鏡反射到不同型號的光電倍增管，實現(xiàn)三次諧波和三光子熒光信號雙通道同步檢測.裝有558/20 nm帶通濾光片(FF01-558/20-25, Semrock)的砷化鎵光電倍增管(H7422p-50, Hamamatsu)用于檢測三次諧波信號，裝有593 nm長波通濾光片(FF01-593/LP-25, Semrock)和630/92 nm帶通濾光片(FF01-630/92-25, Semrock)的鎵砷磷光電倍增管(H7422p-40, Hamamatsu)用于檢測外源性熒光標記物的三光子熒光信號.整個顯微系統(tǒng)通過ScanImage(Vidrio Technoligies)軟件控制，圖像采集速率為2 s/幅，圖像大小為512×512像素.采用ImageJ(NIH)軟件處理獲取的圖像.

圖1 實驗裝置圖

圖2 光纖輸出端的孤子光譜

圖2為光纖輸出端的1 665 nm孤子光譜.采用自建的干涉自相關(guān)儀定量測量孤子脈寬為79 fs.孤子平均功率為110 mW.

1.2 成年小鼠的立體定向注射及腦片制備

本實驗所有研究過程經(jīng)由深圳大學(xué)實驗動物倫理委員會同意.本研究使用的BALB/c小鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，選擇6周雄性普通小鼠注射，立體定向注射裝置如圖3.

首先，使用麻醉機(5101IP, RWD Life Science)對小鼠進行麻醉；然后，將小鼠固定在自行搭建的腦固定儀上，通過體溫維持系統(tǒng)(ALC-HTP, RWD Life Science)維持小鼠體溫(溫度設(shè)置36 ℃)，手術(shù)前將小鼠眼睛涂上白凡士林，防止眼睛脫水失明.用手術(shù)刀將頭皮切開約10 mm，去掉骨膜.使用顱鉆(STRONG204, STRONG)和直徑0.5 mm的鉆頭，在顱點側(cè)后方2 mm處鉆一個直徑500～700 μm的小孔.

利用微電極拉制儀(P-97 Pipette Puller, Sutter Instrument Co.)將硼硅酸玻璃微管(BF120-69-10, Sutter Instrument)拉制成為注射用微針，微針外徑1.2 mm，內(nèi)徑0.69 mm，長度10 cm，玻璃微針尖端直徑20～25 μm，玻璃微管的ramp值為504，參數(shù)設(shè)置為：heat: ramp+25; pull: 0; velocity: 150; time: 0; pressure: 200.通過角度臺調(diào)整小鼠大腦的角度使微針方向垂直于小鼠大腦(圖3).利用微量注射儀(PICOSPRITZER III, Parker)和三維位移臺(MP285, Sutter Instrument Co.)在小鼠大腦的不同深度(1 500、1 200、900、600及300 μm)注射，注射壓力為41.37～55.16 kPa.微針在300 μm位置處停留2 min后離開大腦表面，縫合傷口，并涂上莫匹羅星軟膏預(yù)防感染.AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE病毒滴度不低于2.00×1013vg/mL，每個位置注射量為80～100 nL.其中，hSyn為成熟神經(jīng)元特異性啟動子；jRGECO1[21]為紅色熒光蛋白鈣指示劑；單光子激發(fā)波長為540～580 nm.因此，實驗注射在普通小鼠大腦皮層和海馬體的病毒，能夠促使小鼠神經(jīng)細胞的特異性標記.

圖3 立體定位注射裝置

3周后，將注射的普通小鼠麻醉并處死，取出小鼠大腦后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗，放入腦模具(0.5 mm 40～75 g，瑞沃德)中，在注射位置對大腦進行常溫下切片.

2 腦片的三光子顯微成像

采用上述實驗裝置對普通小鼠腦片無標記三次諧波成像結(jié)果如圖4(a)—(c).由于神經(jīng)細胞體含有小的細胞器，其結(jié)構(gòu)在20～100 nm尺度，這些較小的結(jié)構(gòu)不會產(chǎn)生明顯的三次諧波信號[7]，因此，在圖4(a)的P1位置無法觀察到神經(jīng)細胞的三次諧波圖像，即神經(jīng)細胞位置對應(yīng)的三次諧波圖像呈現(xiàn)出“黑洞”形態(tài).這一實驗結(jié)果與文獻[7]的報道一致.

圖4(d)—(f)對應(yīng)同步采集的三光子熒光圖像.圖4(d)中P2位置的三光子熒光成像結(jié)果可以清楚顯示標記的神經(jīng)細胞.因此，實驗證明通過AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE病毒，可對普通小鼠腦中的神經(jīng)細胞進行標記.結(jié)合1 700 nm波段三光子激發(fā)，可在該波段實現(xiàn)神經(jīng)細胞的三光子熒光成像，如圖4(d)—(f).由成像結(jié)果可知，腺相關(guān)病毒(AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE)主要對神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)進行標記.

三光子熒光成像結(jié)果還表明，該腺相關(guān)病毒(AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE)主要對細胞質(zhì)進行標記(細胞核無熒光信號).該成像結(jié)果存在熒光信號亮度較低的問題，認為是AAV病毒標記效率較低所導(dǎo)致.

以下分析三次諧波與三光子熒光成像結(jié)果的相互關(guān)系.圖4(a)和(d)中P1和P2對應(yīng)位置的三次諧波和三光子熒光圖像互補.圖4(b)為灰質(zhì)和白質(zhì)交界處的三次諧波成像結(jié)果.白質(zhì)處的髓鞘細胞膜[22]，由于髓鞘擁有類脂質(zhì)結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生三次諧波信號.圖4(e)是圖4(b)位置處的三光子熒光成像.通過對比圖4(b)與圖4(e)可見，該標記物只能標記神經(jīng)細胞，無法標記髓鞘，因為髓鞘是寡突細胞而非神經(jīng)細胞的附屬結(jié)構(gòu).圖4(c)和(f)是海馬體CA1層的三次諧波成像和三光子熒光成像.在腦片中可以清楚看到海馬體絲狀結(jié)構(gòu)(神經(jīng)纖維)的三次諧波成像.以上結(jié)果表明，三次諧波對結(jié)構(gòu)敏感，能夠?qū)崿F(xiàn)普通小鼠腦片灰質(zhì)、白質(zhì)和海馬體等結(jié)構(gòu)成像；三光子熒光能夠?qū)崿F(xiàn)腦片灰質(zhì)和海馬體神經(jīng)細胞成像.

圖4 腦片三光子成像

結(jié) 語

通過1 700 nm波段三光子顯微成像技術(shù)，結(jié)合腦部注射技術(shù), 實現(xiàn)AAV9-hSyn-NES-jRGECO1a-WPRE病毒對小鼠大腦灰質(zhì)和海馬體的神經(jīng)細胞特異性標記，在普通小鼠急性腦切片中實現(xiàn)從灰質(zhì)到海馬體的三光子熒光和三次諧波雙通道同時成像.對小鼠大腦注射腺相關(guān)病毒標記神經(jīng)細胞，相應(yīng)三光子熒光成像揭示了細胞結(jié)構(gòu)，采集的三次諧波成像可以提供互補的定位信息.研究成果為神經(jīng)腦科學(xué)，特別是神經(jīng)細胞研究提供一種新穎的可視化技術(shù).今后將開展活體普通小鼠腦部神經(jīng)細胞成像的相關(guān)實驗研究.