蔣 超，林 靜，黃 鵬

深圳大學醫(yī)學部生物醫(yī)學工程學院，廣東深圳518060

肼(N2H4)是一種常見的化工原料，是合成聚合物、紡織染料和醫(yī)藥中間體等的重要前體[1].肼具有易燃易爆特點，被廣泛應用于火箭燃料和重氮燃料的生產(chǎn)中[2].但是，肼對皮膚有很強的侵蝕作用，尤其對眼睛和肝臟等器官有嚴重的損傷作用，被列為常見致癌物之一[3-4].因此，肼的檢測對環(huán)境保護和生命健康都具有重要意義.

目前，關于肼的檢測方法主要有庫侖法[5-6]、電位滴定法[7-8]和熒光檢測法[9-10].其中，庫侖法和電位滴定法操作復雜，檢測時間長，且無法實現(xiàn)活體生物組織檢測[11]；熒光檢測法因具有靈敏度高、采集樣品時間短和時間分辨率高的優(yōu)點而被廣泛用于科學研究[12].然而，熒光成像的激發(fā)光波長范圍通常在400～700 nm，組織穿透深度有限，對于深層組織無法檢測，并且生物組織自發(fā)熒光背景較強，嚴重干擾其在活體生物組織中的應用[13-14].因此，找出一種實時、快速，且可用于活體深層組織肼檢測的方法非常有意義.

光聲檢測(photoacoustic detection, PAD)是一種利用光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)對待測物進行檢測的新技術，主要基于光聲(photoacoustic，PA)探針和檢測物之間的相互作用，根據(jù)PA信號的變化作為指標，實現(xiàn)對待測物的檢測[15].與其他成像方式相比，PAI是一種新興的無創(chuàng)、非電離成像，當脈沖激光射入生物組織時，組織吸收脈沖激光能量轉化為熱能，引發(fā)熱彈性膨脹，從而產(chǎn)生超聲信號，超聲探頭收集到超聲信號并成像.PAI結合了光學成像和超聲成像兩者優(yōu)點，具有對比度豐富、分辨率高和深層組織穿透力強等優(yōu)點[16].因此，PAI可提供深層組織一些特定目標的高分辨率圖像信息[17].目前已開發(fā)出多種基于無機或有機材料的PAI造影劑用于腫瘤和組織器官的成像[18-20].隨著PA探針的發(fā)展，PAD已被廣泛應用于腫瘤診斷[21-22]、離子檢測[23-27]以及酶檢測[28-30]等領域.但是，目前肼檢測的光聲探針還有待開發(fā).

本研究提出了利用花菁類染料為母體，設計并合成了一種新型PA分子探針(Cy-2)，成功實現(xiàn)了對肼的有效檢測.

1 實 驗

1.1 試 劑

2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3二氫-1,3,3-三甲基L-2H-苯并吲哚-2-烯基)-乙烯基]-1-環(huán)己烷-1-基]-乙烯基]-1,3,3-三甲基-1H-苯并吲哚鎓對甲苯磺酸鹽(IR-813，C47H47ClN2O3S)、N,N-二甲基甲酰胺(dimethyl formamide, DMF)、三乙胺(C6H15N triethylamine, TEA)、丙烯酰氯(C3H3ClO)、硫酸鈉(Na2SO4)、硝酸鈉(NaNO3)、氯化銨(NH4Cl)、六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O)、氯化汞(HgCl2)、氯化鎂(MgCl2)、氯化銅(CuCl2)、氯化錳(MnCl2)、醋酸鉛((CH3COO)2Pb)和肼(N2H4·H2O)均購自北京百靈威科技有限公司；乙酸鈉(C2H3NaO2)購自上海薩恩化學科技有限公司；二氯甲烷(CH2Cl2, dichloromethane, DCM)和氯化鈉(NaCl)購自西格瑪-奧德里奇中國；溴化鉀(KBr)、硝酸銀(AgNO3)和氯化鉀(KCl)購自上海麥克林生化科技有限公司.以上所用試劑均為分析純，無特別說明時均未提純處理，且所有溶液均由去離子水(millipore, direct-Q 3 超純水系統(tǒng))配制.

1.2 儀 器

紫外-可見光分光光度計(安捷倫科技(中國)有限公司生產(chǎn)，型號為Cary 60)；小動物活體光聲成像系統(tǒng)(型號為Vevo LAZR2100, VisualSonics富士公司生產(chǎn)).

1.3 合成步驟

本研究合成的Cy-2探針由花菁染料IR-813衍生物Cy-1與烯丙酰氯酯化反應得到，合成步驟如圖1.

圖1 探針Cy-2的合成步驟

1.3.1 Cy-1的合成

在氮氣保護下，將化合物IR-813(305 mg，0.50 mmol)溶于無水DMF(10 mL)中，然后加入乙酸鈉(123 mg, 1.50 mmol).反應混合液加熱至90 ℃，攪拌3 h后，冷卻至室溫.除去溶劑，粗產(chǎn)物使用石油醚和乙酸乙酯(體積比為3∶1)作為洗脫劑洗脫，利用硅膠柱層析分離得到紅色固體粉末Cy-1，151 mg，產(chǎn)率65%.

1.3.2 Cy-2的合成

在氮氣保護下，將化合物Cy-1(780 mg)和TEA(170 mg)溶于無水DCM(20 mL)中，攪拌15 min，然后在冰浴條件下逐滴加入丙烯酰氯(456 mg)的DCM溶液，繼續(xù)攪拌20 min.暖至室溫，攪拌3 h.除去溶劑，使用DCM和甲醇(體積比30∶1)作為洗脫劑洗脫，利用硅膠柱層析分離得到綠色固體粉末Cy-2，392 mg，產(chǎn)率42%.化合物的氫(1H)核磁共振譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)(500 MHz, CDCl3)化學位移δ分別為7.97～7.80 (m, 41H), 7.79 (d,J= 2.4 Hz, 15H), 7.39 (d,J= 30.9 Hz, 28H), 7.28 (s, 9H), 7.15 (s, 9H), 6.92 (d,J= 7.5 Hz, 9H), 6.53～6.33 (m, 9H), 6.26 (s, 9H), 6.06 (dd,J=14.7, 8.1 Hz, 7H), 6.03～5.87 (m, 12H), 5.28 (s, 19H), 5.05 (s, 9H), 4.29 (dd,J=15.0, 6.2 Hz, 9H), 3.30 (s, 27H), 2.72～2.68 (m, 9H), 2.59 (s, 27H), 2.35～2.31 (m, 7H), 2.30～2.26 (m, 7H), 1.83 (s, 1H), 1.79 (d,J= 20.6 Hz, 64H), 1.70 (s, 7H), 1.47 (d,J=16.6 Hz, 63H), 1.39 (s, 7H).電噴霧質譜(electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS)：[M]+= 621.3423(計算得C43H45N2O2+: 621.33).

1.4 溶液配制

探針配制：準確稱取Cy-2探針24.84 mg溶解于4 mL的甲醇中，終濃度為10 mmol/L.

肼及各種離子溶液的配制：通過將肼及各種離子相應的鹽分別為Na2SO4、NaNO3、NaCl、KBr、CH3COONa、NH4Cl、NaCl、KCl、AgNO3、Zn(NO3)2、HgCl2、MgCl2、CuCl2、MnCl2或(CH3COO)2Pb)溶于去離子水中，制備各種離子溶液(SO42-、NO3-、Cl-、Br-、CH3COO-、NH4+、Na+、K+、Ag+、Zn2+、Hg2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+和肼)，濃度均為3 mol/L，備用.

2 結果與分析

2.1 Cy-2對肼的檢測靈敏度研究

為探究Cy-2對肼的光學響應，采用紫外-可見分光光度計測定不同濃度肼對Cy-2的吸收光譜影響；采用小動物光聲成像系統(tǒng)測定加入不同濃度肼后的Cy-2 探針在808 nm處光聲強度P(808)變化.

向Cy-2(10 μmol/L)溶液中，逐漸加入肼(0～10 μmol/L)，測定不同濃度的肼對Cy-2溶液吸收光譜的影響，結果如圖2.隨著溶液中肼濃度的增高，Cy-2溶液體系在波長為808 nm處的光密度D(808)顯著下降，而550 nm處的光密度D(550)明顯升高.同時，在肼濃度由0～10 μmol/L變化時，伴有明顯的顏色變化(圖2插圖).在肼濃度為0～5 μmol/L內(nèi)，Cy-2在808 nm和550 nm處的光密度比值D(808)/D(550)與肼濃度具有良好的線性關系，如圖3.依據(jù)圖3(b)的線性關系，可以根據(jù)D(808)/D(550)比值推算出待測物中肼的濃度.

圖2 Cy-2(10 μmol/L)與不同濃度(0～10 μmol/L)肼反應后的吸收光譜圖

圖3 Cy-2與不同濃度肼反應后的D(808)/D(550)

然后，測定不同濃度的肼對Cy-2溶液光聲強度的影響.向Cy-2(10 μmol/L)溶液中分別加入不同濃度的肼(0～10 μmol/L)，結果如圖4.隨著溶液中肼濃度的增高，探針的P(808)明顯下降，且在一定濃度內(nèi)(0～10 μmol/L)，P(808)與肼濃度具有良好的線性關系，如圖5，肼檢測限為0.50 μmol/L.

圖4 Cy-2與不同濃度肼(0～10 μmol/L)反應后，在808 nm處光聲圖像

圖5 探針P(808)與肼濃度呈線性關系

2.2 Cy-2對肼的檢測選擇性研究

為探究Cy-2對肼的選擇性，利用紫外-可見光譜和光聲成像技術，共同驗證探針Cy-2對肼的識別特異性.向Cy-2(10 μmol/L)的甲醇溶液中，分別加入 100 μmol/L的N2H4、NO3-、Cl-、Br-、SO42-、CH3COO-、NH4+、Na+、K+、Ag+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+和Pb2+，待反應5 min后，檢測各反應溶液的吸收光譜，結果如圖6.由圖6可見，只有加入肼的溶液的吸收峰位置發(fā)生顯著的藍移，在808 nm處的吸收峰消失，在550 nm處出現(xiàn)新的吸收峰，而其他溶液的吸收光譜幾乎沒有變化.如圖7所示，只有加入肼的Cy-2溶液顏色由原來的綠色變成了紅色，D(808)/D(550)比值降低；而加入其他離子的溶液顏色及D(808)/D(550)比值均無明顯變化，表明Cy-2對肼檢測的特異性很好.

圖6 Cy-2與100 μmol/L的肼和其他離子作用的吸收光圖譜

1為Cy-2；2為SO42-；3為NO3-；4為Cl-；5為Br-；6為CH3COO-；7為NH4+；8為Na+；9為K+；10為Ag+；11為Zn2+；12為Hg2+；13為Mg2+；14為Cu2+；15為Mn2+；16為Pb2+；17為N2H4

隨后，利用光聲成像來研究Cy-2對肼的識別特異性.向Cy-2(10 μmol/L)的甲醇溶液中，分別加入100 μmol/L的N2H4、NO3-、Cl-、Br-、SO42-、CH3COO-、NH4+、Na+、K+、Ag+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Hg2+和Pb2+，待反應5 min后，測得各反應液的光聲信號強度.如圖8和圖9，只有加入肼溶液的探針在808 nm處的光聲信號強度下降，而其他離子的加入都不會引起明顯變化，實驗結果再次表明Cy-2對肼具有很好的選擇性.

圖8 Cy- 2分別與肼、其他離子(100 μmol/L)作用后在808 nm處光聲信號變化

1為Cy-2；2為SO42-；3為NO3-；4為Cl-；5為Br-；6為CH3COO-；7為NH4+；8為Na+；9為K+；10為Ag+；11為Zn2+；12為Hg2+；13為Mg2+；14為Cu2+；15為Mn2+；16為Pb2+；17為N2H4

結 語

本研究設計并合成了一種以花菁類染料為母體的光聲分子探針Cy-2，實現(xiàn)了肼的光聲檢測.該探針在波長808 nm處具有較強的光聲信號.當探針分子與肼作用后，隨著溶液中肼濃度的增高，分子探針在808 nm處的光密度顯著下降，而550 nm處的光密度明顯升高，且在一定濃度范圍內(nèi)(0～10 μmol/L)，D(808)/D(550)與肼濃度具有良好的線性關系.同時，新型分子探針808 nm處的光聲信號強度也隨著肼濃度增加而降低，在肼濃度為0～10 μmol/L內(nèi)，P(808)與肼濃度呈良好的線性關系，肼檢測限為0.50 μmol/L.該探針合成方法簡單，并能夠對肼實現(xiàn)快速高效的光聲檢測，有望用于在體或深層組織肼的檢測.

致 謝：感謝深圳大學麗湖校區(qū)測試中心的支持！