高書慧 趙俊偉

自1882年德國(guó)科學(xué)家Robert Koch發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的病原體——結(jié)核分枝桿菌以來(lái)，結(jié)核病作為全球十大死因之一，一直困擾著人類的生存與健康[1]。外泌體內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物，目前已成為結(jié)核病診斷治療的新熱點(diǎn)，穩(wěn)定且特異的外泌體非編碼RNA有望成為結(jié)核病早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷的新靶標(biāo)[2-6]。

外泌體與結(jié)核分枝桿菌感染

一、外泌體的形成與分泌

外泌體是釋放到細(xì)胞外的直徑為30～100 nm的膜性胞外囊泡，1983年在成熟綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中被首次發(fā)現(xiàn)[7]。幾乎所有的細(xì)胞類型都釋放富含血漿及其他體液的外泌體，并在血液、乳液、尿液等各種體液中循環(huán)。外泌體作為新的研究領(lǐng)域，已成為多種疾病診斷與治療的突破點(diǎn)，結(jié)核病就是其應(yīng)用的一個(gè)典型案例。

外泌體的形成與分泌包括4個(gè)基本過(guò)程：起始、內(nèi)吞、多囊泡體形成和分泌。首先，在各種刺激因素下產(chǎn)生的外泌體核酸、蛋白質(zhì)等通過(guò)質(zhì)膜內(nèi)陷，形成早期內(nèi)體；隨后，早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體(多囊泡)，并在其內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)內(nèi)腔小泡；最后，多囊泡或與溶酶體融合被降解，或與細(xì)胞膜融合外吐出內(nèi)腔小泡成為外泌體[8]。因?yàn)橥饷隗w內(nèi)包含著脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)、酶等各種信息物質(zhì)，所以它是一種重要的細(xì)胞間信息傳遞載體，反映著供體的細(xì)胞組成以及受到調(diào)控的分選機(jī)制[9]。目前，外泌體已成為癌癥、心腦血管疾病等研究中的熱點(diǎn)[10-11]；同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌本身所產(chǎn)生的外泌體及被結(jié)核分枝桿菌感染的細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體都對(duì)宿主免疫及疾病的診斷有著很大的影響[12-14]。

二、外泌體作為信使分子參與宿主與結(jié)核分枝桿菌的相互作用

外泌體與相應(yīng)的受體作用后，改變受體細(xì)胞的表型或功能，從而改變靶細(xì)胞的生理效應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和病原體毒性等，一方面可利于感染的控制，另一方面也可促進(jìn)感染的傳播[9]，均表明外泌體使宿主細(xì)胞之間或病原體與宿主細(xì)胞之間的聯(lián)系成為可能。

(一)宿主來(lái)源外泌體的作用效應(yīng)

結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)機(jī)體最突出的表現(xiàn)是巨噬細(xì)胞的激活和干擾素因子的釋放[15]，外泌體通過(guò)一系列舉措對(duì)這兩種表現(xiàn)產(chǎn)生影響。感染的巨噬細(xì)胞所分泌的外泌體包含結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原，這些外泌體內(nèi)容物的釋放，將激活巨噬細(xì)胞及CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞，從而發(fā)生免疫應(yīng)答以對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌。與此同時(shí)，感染的巨噬細(xì)胞所分泌的外泌體促進(jìn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等各種炎癥因子釋放，TNF通過(guò)放大炎癥反應(yīng)從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答[9]。有研究報(bào)道，含有結(jié)核分枝桿菌脂蛋白LpqH的外泌體可通過(guò)Toll樣受體/MyD88途徑促進(jìn)炎癥并促進(jìn)體外巨噬細(xì)胞激活和TNF-α的表達(dá)[16]。

值得注意的是，外泌體在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)是動(dòng)態(tài)和多因素的，外泌體也可通過(guò)阻斷γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)調(diào)節(jié)通路，抑制其表面抗原呈遞作用和機(jī)體免疫應(yīng)答。感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞所分泌的外泌體因含有結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁糖脂成分——脂阿拉伯甘露聚糖，從而抑制T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和T細(xì)胞激活反應(yīng)。這兩方面調(diào)節(jié)作用促進(jìn)了結(jié)核分枝桿菌在感染細(xì)胞中的存活[17]。

(二)結(jié)核分枝桿菌外泌體的作用效應(yīng)

結(jié)核分枝桿菌分泌的外泌體通過(guò)其攜帶的多種病原相關(guān)分子模式，激發(fā)免疫反應(yīng)[18]。有研究報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌膜囊泡對(duì)宿主細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β的釋放有促進(jìn)作用，而對(duì)IL-10的釋放無(wú)明顯影響，這最終決定了機(jī)體免疫反應(yīng)與細(xì)胞凋亡作用效應(yīng)的改變[19]。結(jié)核分枝桿菌釋放的膜囊泡在抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞功能的同時(shí)促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類抗原呈遞，在感染巨噬細(xì)胞以及向未感染免疫細(xì)胞傳遞微生物組分中扮演著十分重要的角色[20]。結(jié)核分枝桿菌釋放的膜囊泡也可以誘導(dǎo)Th1型免疫高反應(yīng)，增強(qiáng)卡介苗的疫苗效應(yīng)進(jìn)而增強(qiáng)體液免疫與細(xì)胞免疫[21]，這些發(fā)現(xiàn)提示了用結(jié)核分枝桿菌的膜囊泡作為保護(hù)性疫苗的可能性。

外泌體非編碼RNA與結(jié)核病診斷

一、結(jié)核病的分子診斷

結(jié)核病的診斷主要從病原學(xué)、免疫學(xué)、分子診斷等方面著手。其中分子診斷方法因具有速度快、敏感度和特異度較高等優(yōu)勢(shì)，在結(jié)核病防控中發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前，基于DNA分子的檢測(cè)技術(shù)占據(jù)主流[22-23]，但對(duì)于鑒別結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)是否存活仍無(wú)能為力。

眾所周知，RNA的拷貝數(shù)大于DNA，在生命力旺盛的病原體中RNA較DNA更活躍。同時(shí)由于RNA易降解、半衰期短[24]，因此對(duì)活的結(jié)核分枝桿菌的診斷具有極大的優(yōu)勢(shì)。例如，結(jié)核分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)(simultaneous amplification and testing，SAT)技術(shù)的產(chǎn)物和模板均為RNA，具有較高敏感度，特異度可達(dá)100%，大大減少了死菌的污染[25]。近年來(lái)，非編碼RNA在結(jié)核病診斷方面開(kāi)始受到關(guān)注，可能是區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)的一個(gè)有力指標(biāo)，為L(zhǎng)TBI的診斷帶來(lái)了曙光[26]。

二、非編碼RNA與結(jié)核病

非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括微小RNA(micro RNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)等。

miRNA在結(jié)核病診斷與治療上吸引著越來(lái)越多研究者的關(guān)注。如miR-140通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)表達(dá)[27]，miR-1178通過(guò)靶向Toll 樣受體4(TLR-4)的調(diào)節(jié)，減弱結(jié)核分枝桿菌感染所誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平，miR-20a-5p通過(guò)靶向c-Jun 氨基末端激酶2(c-Jun N-terminal kinase-2，JNK2)信號(hào)抑制巨噬細(xì)胞凋亡[28-29]，miR-27a通過(guò)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CACNA2D3抑制結(jié)核分枝桿菌自噬[3]，促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的存活。同時(shí)，有研究報(bào)道，利用差異表達(dá)miRNA可進(jìn)行結(jié)核感染進(jìn)展與疾病預(yù)測(cè)，如miR-769-5p、miR-320a和miR-22-3p在結(jié)核病患者和健康對(duì)照者之間的差異表達(dá)，具有區(qū)分結(jié)核病患者和健康對(duì)照者的潛力[2]；hsa-miR-212-3p在LTBI者中的高表達(dá)，與結(jié)核潛伏感染相關(guān)信號(hào)通路的活化有關(guān)[30]?？偠灾琺iRNA在結(jié)核感染過(guò)程中可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，積極參與自噬與凋亡反應(yīng)，維持結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的存活；同時(shí)，利用差異表達(dá)的miRNA可進(jìn)行結(jié)核病的早期診斷。

lncRNA通過(guò)參與免疫反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞凋亡與自噬影響結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程，有望成為結(jié)核病診斷新的候選標(biāo)志物與治療靶標(biāo)。外周血單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA在多耐藥結(jié)核病患者、藥物敏感結(jié)核病患者和健康對(duì)照者中表達(dá)存在差異，揭示某些lncRNA可能與調(diào)節(jié)宿主對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)有關(guān)[31]。在結(jié)核分枝桿菌感染期間，外周血單核細(xì)胞中的lncRNA 核富集轉(zhuǎn)錄體1(nuclear-enriched autosomal transcript 1，NEAT1)表達(dá)增加，其水平隨著治療而逐漸下降，表明lncRNA NEAT1與結(jié)核病的療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷有關(guān)[5]?；顒?dòng)性結(jié)核病患者單核細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCED1B-AS1表達(dá)下調(diào)，同時(shí)單核細(xì)胞凋亡減弱、自噬增強(qiáng)，提示它們可以作為肺結(jié)核的新潛在治療靶標(biāo)[32]。

circRNA是結(jié)核病診斷標(biāo)志物的一個(gè)研究熱點(diǎn)，其差異表達(dá)可用于結(jié)核病的早期判斷。與健康對(duì)照者相比，活動(dòng)性結(jié)核病患者體內(nèi)一些circRNA明顯升高或降低，且其數(shù)量與結(jié)核病的嚴(yán)重程度相關(guān)[33-35]，其失調(diào)可能在活動(dòng)性結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[36-37]。因此，circRNA可以用作結(jié)核病診斷的潛在生物標(biāo)志物。

三、外泌體非編碼RNA

外泌體中包含著各種物質(zhì)，其中核酸的存在備受人們的關(guān)注[38]。有研究報(bào)道，在腸病毒A71 引起的手足口病中，外泌體miR-155通過(guò)抑制磷脂酰肌醇網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)腸病毒A71感染在宿主-病原體相互作用中發(fā)揮作用[39]。因?yàn)橥饷隗w是脂質(zhì)雙層膜，可發(fā)揮堡壘的作用，避免其內(nèi)的核酸等被降解，使核酸保持穩(wěn)定性。因此，外泌體內(nèi)的核酸可作為乙型肝炎病毒和弓形蟲(chóng)等感染性疾病診斷的候選物[40-41]。

經(jīng)卡介苗感染的巨噬細(xì)胞釋放的外泌體miRNA可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)過(guò)程[42-43]。結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞釋放的外泌體含有一系列不同的miRNA以及病原體衍生的結(jié)核分枝桿菌特異性的RNA，可以用于輔助診斷結(jié)核感染的狀態(tài)[44]。另外，有研究者研究了肺腺癌、肺結(jié)核和其他良性病變胸腔積液中差異表達(dá)的外泌體miRNA，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的不同，因此差異的外泌體miRNA有希望作為鑒別胸腔積液性質(zhì)的生物標(biāo)志物[45]。外泌體miR-20b-5p能夠影響結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞的活力和凋亡[46]，外泌體miR-484、miR-425和miR-96在結(jié)核病患者血清中表達(dá)明顯升高，與結(jié)核感染水平相關(guān)，表明這些外泌體miRNA對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病具有較高的診斷潛力[47]。Hu等[48]發(fā)現(xiàn)結(jié)核外泌體miR-20a、miR-20b、miR-26a、miR-106a、miR-191、miR-486在肺結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎和健康對(duì)照者之間存在差異表達(dá)，整合這些外泌體RNA和患者電子病歷信息能明顯提高肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷效能。此外，國(guó)內(nèi)Lv等[49]觀察到了活動(dòng)性結(jié)核病患者、LTBI者與健康對(duì)照者之間血清外泌體RNA表達(dá)譜的明顯差異，生物通路分析表明活動(dòng)性結(jié)核病患者較LTBI者有更多的信號(hào)通路被明顯抑制，在疾病由LTBI發(fā)展到活動(dòng)性結(jié)核病的過(guò)程中，這些被抑制的信號(hào)通路逐漸被激活。此后，Lyu等[50]又分析了小RNA譜在以上3種不同結(jié)核感染狀態(tài)下的表達(dá)差異，提示在結(jié)核感染不同狀態(tài)下某些miRNA在LTBI者中存在特異表達(dá)，為區(qū)分LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病這兩種不同的感染狀態(tài)提供了可能性?？傊?，外泌體非編碼RNA在結(jié)核病診斷生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定研究中報(bào)道較少，是未來(lái)的一個(gè)研究方向。

展 望

目前，結(jié)核病疫情依舊嚴(yán)峻，其防控問(wèn)題亟待解決，發(fā)現(xiàn)傳染源是目前結(jié)核病控制的核心[51]。外泌體非編碼RNA在結(jié)核病早期診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景，是目前研究的熱點(diǎn)。但是，由于外泌體內(nèi)非編碼RNA含量甚微，外泌體自身提取純化成本較高，且對(duì)于來(lái)源不同的外泌體難以分離與鑒別。因此，如何高效經(jīng)濟(jì)地提取純化結(jié)核外泌體，從中篩選和鑒定出可用于結(jié)核病早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷的外泌體非編碼RNA，仍需進(jìn)一步探索。