王 碩，張志華

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，河北 承德 067000)

近年來，mNGS正在從實驗室研究發(fā)展階段應(yīng)用于臨床實驗室診斷，改變了臨床醫(yī)生診斷和治療感染性疾病和腫瘤以及人類宿主基因表達(dá)異常(轉(zhuǎn)錄組)等各類疾病的方式。mNGS技術(shù)是將通用接頭連接到要測序的片段化基因組DNA,然后使用不同的方法產(chǎn)生數(shù)千萬的單分子多克隆聚合酶鏈反應(yīng)陣列,然后進(jìn)行大規(guī)模的引物雜交及酶延伸反應(yīng)。2005年二代測序(Next-generation sequencing,NGS)技術(shù)的出現(xiàn)使宏基因組學(xué)迅速發(fā)展，這是第一次可以同時對幾十萬甚至幾百萬的讀數(shù)進(jìn)行測序,并且可以同時檢測反應(yīng)后每個步驟產(chǎn)生的信號,通過計算機(jī)分析獲得完整的DNA序列信息以得到臨床或環(huán)境樣本的整個遺傳內(nèi)容[1]，測序成本降低推動了mNGS技術(shù)的普及，且因其檢測速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋范圍廣等優(yōu)勢,具有良好的臨床應(yīng)用發(fā)展趨勢，本文就mNGS的臨床微生物學(xué)分析、病原體-宿主相互作用研究、腫瘤學(xué)和面臨的挑戰(zhàn)等方面進(jìn)行綜述。

1 臨床宏基因組學(xué)的應(yīng)用

1.1 病原微生物的鑒定：醫(yī)學(xué)微生物學(xué)是研究微生物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、分類和社會革命活動規(guī)律的一門科學(xué)，包括細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)、真菌學(xué)等。微生物學(xué)的傳統(tǒng)實驗室診斷技術(shù)包括培養(yǎng)鑒定、病原體的特異性抗體(血清)或抗原的檢測及其核酸(DNA或RNA)的分子生物學(xué)鑒定，目前最常用的檢測方法為PCR和RT-PCR(多聚酶鏈反應(yīng))。然而，分子生物學(xué)鑒定必須使用特定的引物或探針靶向鑒定特定的病原體，檢測的病原體種類非常有限。宏基因組學(xué)可以檢測樣本中所有物種的DNA或RNA，能夠快速分析患者樣品中整體微生物群以及人類宿主基因組和轉(zhuǎn)錄組，因此，mNGS對于發(fā)現(xiàn)新型病原體并檢測健康和患病狀態(tài)下的人類具有顯著優(yōu)勢。

文獻(xiàn)表明目前仍有20%～60%的病例未檢測到致病病原體[2]，基于高通量測序的宏基因組學(xué)研究給病原體的識別鑒定帶來了新的方法和思路，mNGS可檢測臨床樣本中病原體的全部基因信息，獲得有關(guān)主要抗原和毒力基因，并進(jìn)行病毒基因分型，實現(xiàn)對新興病原體的識別、分型和溯源。Samarkos等通過全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)中國和美國的COVID-19的分離株聚集在同一系統(tǒng)進(jìn)化枝中，并發(fā)現(xiàn)其與兩種蝙蝠SARS樣冠狀病毒(Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21)的同源性為86.9%，故判斷其為一種新型冠狀病毒[3]，研究還發(fā)現(xiàn)中國和美國COVID-19分離株的基因組序列在核苷酸水平上的同源性高達(dá)99.8%至100%，判斷其為同一種冠狀病毒。綜上，基于mNGS對COVID-19的全面分析一定能獲得該病毒的起源、傳播途徑以及物種屏障等相關(guān)信息，進(jìn)而為傳染病的預(yù)防、控制提供依據(jù)。

1.2 病原微生物組學(xué)分析：mNGS正在逐漸取替16S rDNA基因的靶向測序，以實現(xiàn)我們對不同環(huán)境微生物組成的檢測鑒定[4]。廣譜抗生素長期大量應(yīng)用和胃腸外科手術(shù)等多種因素導(dǎo)致腸道菌群比例失調(diào)，發(fā)生感染[5]，嚴(yán)重時可導(dǎo)致危及生命的暴發(fā)性偽膜性腸炎和中毒性巨結(jié)腸。其中治療方法之一為糞便菌群移植，成功率高達(dá)80～90%，間接證明微生物組學(xué)研究有助于治療艱難梭菌感染[6]。腸道宏基因組相關(guān)研究顯示腸道菌群與肥胖、糖尿病、炎癥性腸病等疾病密切相關(guān)，通過mNGS鑒定腸道菌群失衡有助于靶向菌群移植治療[7]，此外，通過mNGS分析微生物組的多樣性可以對宿主的健康和疾病狀態(tài)進(jìn)行評估，Boulange等發(fā)現(xiàn)不同肺部疾病的肺泡灌洗液具有不同的微生物群落[8]。以微生物為靶點,利用mNGS干預(yù)微生物組必將成為臨床治療新的探索方向。

1.3 病原體-宿主相互作用研究:mNGS基因表達(dá)分析具有互補(bǔ)作用，通過檢測微生物表達(dá)產(chǎn)物的RNA-seq讀數(shù)可以把感染、定植和活菌與死菌區(qū)別出來[9]，實現(xiàn)了包括葡萄球菌、白色念珠菌、結(jié)核和流感的診斷治療[10～12]?；诓≡w的特異性宿主反應(yīng)也可用于診斷復(fù)雜感染病例，例如膿腫和呼吸道分泌物等。此外，對于測序結(jié)果的二次數(shù)據(jù)(即結(jié)合微生物和宿主基因表達(dá)數(shù)據(jù))挖掘可提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。

1.4 在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用:在腫瘤發(fā)生機(jī)制中，mNGS可鑒定與癌癥相關(guān)的病毒(包括皰疹病毒、乳頭瘤病毒、肝炎病毒、EB病毒等)和病毒-宿主相互作用的數(shù)據(jù)[13]。根據(jù)病毒感染及其參與的信號通路為靶向抗病毒和(或)化療藥物的使用提供信息[14]，丙型病毒性肝炎通過抗病毒治療后肝癌的風(fēng)險性降低。目前，臨床mNGS主要應(yīng)用于晚期腫瘤的用藥指導(dǎo)，多基因、多位點突變的檢測技術(shù)較傳統(tǒng)檢測手段具有顯著優(yōu)勢。此外，腫瘤DNA變異在腫瘤早期或腫瘤負(fù)荷較小時便出現(xiàn)于血液中,通過對血液中的游離DNA的檢測可以實現(xiàn)腫瘤的早期診斷或判斷是否疾病進(jìn)展，mNGS還可用于腫瘤術(shù)后的復(fù)發(fā)監(jiān)測、診斷微小殘留病灶等，為腫瘤患者的個體化診療提供依據(jù)。

2 臨床應(yīng)用面臨的挑戰(zhàn)

mNGS技術(shù)的不斷完善正在推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)模式的發(fā)展，該技術(shù)仍存在諸多問題限制其在病原體檢測方面的應(yīng)用和發(fā)展，首先，mNGS的測定結(jié)果缺乏重復(fù)性和質(zhì)量保證，而且成本、報銷問題也是臨床mNGS實施的障礙,此外，mNGS的檢測也是一項十分繁復(fù)的工作，需要定制質(zhì)量管理以達(dá)到監(jiān)管目的，另外，不規(guī)范的實驗操作也可能引起外源性背景菌的污染從而增加診斷難度，故在臨床應(yīng)用之前，需進(jìn)行重復(fù)性驗證研究以獲得可信度高的測序結(jié)果。

2.1 實驗流程:mNGS檢測前需要嚴(yán)格的樣品處理方案以避免錯誤和交叉感染，包括樣品收集、核酸提取、文庫制備等過程，在上述過程中即使微量外源性DNA或RNA混進(jìn)待測樣本也可被檢測出來從而干擾測序結(jié)果，由于樣品處理的輕微偏差都會導(dǎo)致測序結(jié)果發(fā)生較大差異，所以需要將工作流程分為連續(xù)的幾個步驟，工作人員只需負(fù)責(zé)自己的工作步驟，這樣有助于避免實驗錯誤，此外，背景微生物數(shù)據(jù)庫(包括mNGS測序過程中檢測到的正常微生物和污染產(chǎn)生的微生物)的建立至關(guān)重要，通過排除背景微生物以實現(xiàn)臨床診斷，除此之外，還需要制定參考標(biāo)準(zhǔn)以確保mNGS的測序質(zhì)量和實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。

2.2 生物信息學(xué)技術(shù):mNGS在我國臨床感染性疾病的診斷中尚未普及,現(xiàn)有檢測機(jī)構(gòu)的測序方法，不僅生物信息算法存在差異,而且所用的數(shù)據(jù)庫也有所不同,導(dǎo)致微生物的鑒定以及豐度計算方面均存在差別，為保證臨床mNGS數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，必須對生物信息分析過程中每個數(shù)據(jù)處理步驟進(jìn)行評估分析，包括計算機(jī)數(shù)據(jù)和臨床樣本數(shù)據(jù)。微生物基因組的公共數(shù)據(jù)庫包括國家信息中心數(shù)據(jù)庫(National Center for Information Biotechnology Information,NCBI)和華大基因數(shù)據(jù)庫，對于目前臨床mNGS應(yīng)用來說，數(shù)據(jù)庫的綜合分析和整合更有利于數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，另外，需要對微生物測序讀數(shù)設(shè)定閾值以明確具有臨床意義的微生物。

mNGS對于感染性疾病的診治方面具有不可忽略的臨床應(yīng)用價值，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，mNGS必將成為臨床病原體檢測的常規(guī)方法，為實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療做出貢獻(xiàn)。