李智奎 孔俊博 趙王林

(云南省中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，昆明 650021)

骨質(zhì)疏松癥是由骨代謝障礙引發(fā)的一種全身性疾病，臨床表現(xiàn)為骨密度減少、骨脆性增加、骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，容易發(fā)生骨折等，常見(jiàn)于老年人[1]。隨著我國(guó)社會(huì)逐步的老齡化、骨質(zhì)疏松癥也日漸成為影響人們生活健康的主要因素，因此針對(duì)骨質(zhì)疏松的治療就顯得尤為迫切和重要[2]。目前針對(duì)骨質(zhì)疏松的致病原因特別是發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，臨床上對(duì)骨質(zhì)疏松的治療效果不是很理想，越來(lái)越多的證據(jù)表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能異常是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的原因之一[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種來(lái)源于中胚層具有多向分化功能的細(xì)胞，在特定的刺激條件下可以向骨或者脂肪轉(zhuǎn)化，是治療骨質(zhì)疏松癥的理想方案[4]。MSCs在成骨或者成脂分化方向主要由不同的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，目前研究認(rèn)為其成脂分化由特異性基因PPARγ、Adipsin和FABP4調(diào)控，而成骨分化主要由RUNX2、ALP和OPN調(diào)控[5]。研究認(rèn)為促進(jìn)骨MSCs成脂分化的調(diào)控因子同時(shí)會(huì)抑制其成骨分化，反之亦然[6]。MSCs向成脂方向分化增加則成骨分化減少，此時(shí)骨髓內(nèi)的脂肪含量會(huì)增加，從而導(dǎo)致成骨分化的減少，長(zhǎng)期則會(huì)造成骨質(zhì)疏松癥。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，對(duì)骨質(zhì)疏松具有很好的治療效果。淫羊藿苷是一味傳統(tǒng)的溫腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨的中藥，在臨床上經(jīng)常用來(lái)治療骨質(zhì)疏松。有文獻(xiàn)報(bào)道淫羊藿苷可以有效促進(jìn)MSCs向成骨方向分化而抑制其成脂分化[7]，但是其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

因此本研究以大鼠的MSCs為研究對(duì)象，探討了不同濃度淫羊藿苷對(duì)其成骨成脂分化的作用以及具體的機(jī)制，為淫羊藿苷在臨床上治療骨質(zhì)疏松提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料 1周齡SD大鼠乳鼠(中科院昆明動(dòng)物研究所，中國(guó))；淫羊藿苷(云南省食品藥品檢驗(yàn)所，中國(guó))；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液(HyClone，美國(guó))；蛋白酶抑制劑(Roche，美國(guó))；青鏈霉素混合液(Solarbio，北京)；β-actin、RUNX2、ALP、OPN、PPARγ、Adipsin和FABP4抗體(Abcam，英國(guó))；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Advansta，兔二抗購(gòu)自英國(guó) Abcam；CCK-8試劑盒(湖北天根生物，中國(guó))；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)；Wnt/β-catenin信號(hào)通路小分子抑制劑PNU-74654(selleck，美國(guó))；堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒(Wako,日本)；骨鈣素檢測(cè)試劑盒(信然生物，中國(guó))。

1.2方法

1.2.1大鼠MSCs的分離培養(yǎng)和純化 SD大鼠乳鼠脫臼處死，無(wú)菌手術(shù)操作臺(tái)取出大鼠雙側(cè)的股骨和脛骨。隨后消毒的手術(shù)剪在股骨和脛骨干骺端處剪斷，5 ml無(wú)菌注射器抽取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，然后反復(fù)沖洗骨髓腔。將沖洗液混勻后，制備成細(xì)胞懸液接種至5 cm2培養(yǎng)瓶中，5%CO2和37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱。48 h后換液，之后每2 d換一次液。當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%左右，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照1∶2比例接種至75 cm2培養(yǎng)瓶中，以此方法獲得第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞備用。

1.2.2免疫熒光檢測(cè)CD44和CD90 各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，鋪板爬片，4%多聚甲醛固定，細(xì)胞破膜液浸泡破膜，PBS清洗，加入熒光標(biāo)記的CD44和CD90一抗后4℃過(guò)夜，次日室溫30 min后吸取一抗PBS清洗，隨后顯色脫水，封片，熒光顯微鏡下觀察CD44和CD90表達(dá)情況。

1.2.3qRT-PCR TRIzol和氯仿用來(lái)提取獲得RNA，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成性質(zhì)穩(wěn)定的cDNA。隨后qRT-PCR儀器檢測(cè)目的基因相對(duì)β-actin的表達(dá)水平。反應(yīng)條件設(shè)定如下：在95℃預(yù)變性10 min；在95℃下退化10 s;在60℃下退火20 s并在72℃下延伸35 s。該2-ΔΔCt方法用于計(jì)算目的基因相對(duì)mRNA表達(dá)。引物序列如下。RUNX2：Forward 5′-GCACCCAGCCCATAATAGA-3′，Reverse 5′-TTGGAGCAAGGAGAACCC-3′；ALP：For-ward 5′-CAAGGACCAACTACAACCA-3′，Reverse 5′-AG-GGAAGGGTCAGTCAGGTT-3′；OPN：Forward 5′-CCTGGACCTCATCAGCATTT-3′，Reverse 5′-GGAGACAGGAGGCAAGG-3′；PPARγ：Forward 5′-CCTTTACCACGGTTGATTTCTC-3′，Reverse 5′-GGCTCTACTTTGATGCACTTT-3′；Adipsin：Forward 5′-CACGTGTGCGGTGGCACCCTG-3′，Reverse 5′-CCCCTGCAAGTGTCCCTGCGGT-3′；FABP4：Forward 5′-GCGTAGAAGGGGACTTGGTC-3′，Reverse 5′-TTCCTGTCATCTGGGGT-GATT-3′；β-actin：Forward 5′-ACCCACTCCTCCACCT-TTG-3′，Reverse 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.4CCK-8增殖實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔鋪板，隨后分別加入不同濃度的淫羊藿苷(10、20、30、40和50 ng/ml)，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對(duì)照組，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～4 d。結(jié)束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設(shè)置酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)細(xì)胞CCK-8混合液OD值進(jìn)行活力分析。

1.2.5PNU-74654對(duì)淫羊藿苷作用于MSCs成骨和成脂分化的影響 Wnt/β-catenin信號(hào)通路的小分子抑制劑PNU-74654(10 μmol/L)作用于MSCs 30 min以阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，接著用淫羊藿苷(10 ng/ml)刺激MSCs，并與MSCs共孵育3 d，檢測(cè)成骨和成脂基因的表達(dá)。

1.2.6Western blot 調(diào)整MSCs細(xì)胞數(shù)5×104ml-1，80%細(xì)胞密度時(shí)收集細(xì)胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過(guò)夜。次日反復(fù)清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.7骨鈣素活性檢測(cè) 收集對(duì)數(shù)期MSCs，調(diào)整細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔鋪板，隨后分別加入不同濃度的淫羊藿苷(10 ng/ml和40 ng/ml)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～3 d。分別于培養(yǎng)第1、2、3天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)上清液，并密封置于-20℃冰箱保存。于第3天時(shí)將所有收集的上清液置于37℃溫箱解凍后,按信然生物有限公司OC測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，設(shè)置酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)細(xì)胞上清OD值進(jìn)行活力分析。

2 結(jié)果

2.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定 全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)初期細(xì)胞以懸浮為主，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸貼壁生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出各種形態(tài)，顯微鏡觀察多數(shù)呈梭形的成纖維細(xì)胞樣。而CD44和CD90作為MSCs的陽(yáng)性標(biāo)志，為了鑒定分離的細(xì)胞是否為MSCs，免疫熒光觀察CD44和CD90的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)志CD44和CD90均表現(xiàn)出紅色熒光遍布胞質(zhì)(圖1)，說(shuō)明分離的細(xì)胞為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 為了檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)MSCs分化的影響，首先檢測(cè)了其對(duì)MSCs增殖作用的影響，10、20、30、40和50 ng/ml 不同濃度的淫羊藿苷分別作用于MSCs 1～4 d，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對(duì)照組，隨后每天CCK-8試劑盒檢測(cè)MSCs增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10、20、30和40 ng/ml淫羊藿苷在1～4 d對(duì)MSCs增殖均無(wú)影響，但50 ng/ml淫羊藿苷在第3～4天時(shí)明顯抑制MSCs增殖(P<0.05)，見(jiàn)圖2。這說(shuō)明低濃度的淫羊藿苷對(duì)MSCs增殖無(wú)影響，而高濃度的淫羊藿苷起到抑制MSCs增殖的作用，因此后續(xù)研究不同濃度的淫羊藿苷分別以10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷作為給藥濃度。

2.3淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響 MSCs向成脂方向分化則成脂的特異性基因PPARγ、Adipsin和FABP4表達(dá)會(huì)增加。為了檢測(cè)不同濃度淫羊藿苷對(duì)MSCs成脂分化的影響，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對(duì)照組，隨后qRT-PCR和Western blot檢測(cè)PPARγ、Adipsin和FABP4表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，10 ng/ml的淫羊藿苷抑制PPARγ、Adipsin和FABP4的表達(dá)(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷與空白對(duì)照組相比，則PPARγ、Adipsin和FABP4的表達(dá)明顯增加(P<0.05),見(jiàn)圖3。說(shuō)明10 ng/ml 的淫羊藿苷可以抑制MSCs的成脂分化，而40 ng/ml淫羊藿苷可以促進(jìn)MSCs的成脂分化。

圖1 免疫熒光檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)志CD44和CD90的表達(dá)Fig.1 Immunofluorescence detection of bone marrow mesenchymal stem cell positive markers CD44 and CD90 expression

圖2 不同濃度淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of icariin on proliferation of bone marrow mesenchymal stem cellNote:*.P<0.05,***.P<0.001.

2.4淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響 MSCs的成骨分化與成脂分化是雙向的，那么10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷成脂分化的不同作用，是否也體現(xiàn)在對(duì)MSCs的成骨分化作用上。同樣以10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，以正常培養(yǎng)MSCs為空白對(duì)照組，隨后qRT-PCR和Western blot檢測(cè)成骨特異性基因RUNX2、ALP和OPN表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，10 ng/ml的淫羊藿苷顯著增加RUNX2、ALP和OPN的表達(dá)(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷與空白對(duì)照組相比，則RUNX2、ALP和OPN的表達(dá)顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖4。說(shuō)明10 ng/ml的淫羊藿苷可以促進(jìn)MSCs的成骨分化，而40 ng/ml淫羊藿苷可以抑制MSCs的成骨分化。與淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化結(jié)果相符合。

2.5淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣素活性的影響 為了進(jìn)一步驗(yàn)證10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對(duì)MSCs成骨分化的影響，骨鈣素檢測(cè)試劑盒用來(lái)檢測(cè)MSCs骨鈣素活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，10 ng/ml淫羊藿苷可以顯著提高骨鈣素的活性(P<0.05)；而40 ng/ml的淫羊藿苷則降低骨鈣素的活性(P<0.05)，見(jiàn)圖5。說(shuō)明10 ng/ml淫羊藿苷可以促進(jìn)MSCs成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞體外鈣化，提高細(xì)胞內(nèi)骨鈣素活性，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成。

圖3 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響Fig.3 Effects of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:A.qRT-PCR results;B.Western blot result.**.P<0.001,***.P<0.05

2.6淫羊藿苷激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中Wnt/β-catenin信號(hào)通路 為了探究淫羊藿苷誘導(dǎo)MSCs成骨成脂分化中Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮的作用。用10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷分別刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0、30和60 min后，提取蛋白，Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、Wnt7和GSK-3β。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷均可以顯著提高Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化標(biāo)志蛋白β-catenin和Wnt7的表達(dá)(P<0.05)，抑制β-catenin降解蛋白GSK-3β的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖6。且這種蛋白調(diào)控表達(dá)均在淫羊藿苷給藥30 min時(shí)達(dá)到最高值。說(shuō)明不同濃度的淫羊藿均是激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路干預(yù)MSCs成骨分化或者成脂分化的。

圖4 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響Fig.4 Effects of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:A.qRT-PCR results;B.Western blot result.**.P<0.001.

圖5 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨鈣素活性的影響Fig.5 Effect of 10 ng/ml and 40 ng/ml icariin on osteocalcin activity of bone marrow mesenchymal stem cellsNote:*.P<0.05.

圖6 10 ng/ml和40 mg/ml淫羊藿苷對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin、Wnt7和GSK-3β的影響Fig.6 Effects of 10 ng/ml and 40 mg/ml icariin on Wnt/β-catenin signaling pathway-related proteins β-catenin,Wnt7 and GSK-3βNote:**.P<0.01,***.P<0.001.

圖7 10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的促成骨基因表達(dá)和抑成脂基因表達(dá)的效應(yīng)被PNU-74654 部分阻斷Fig.7 Effect of 10 ng/ml and 40 mg/ml icariin on bone-promoting gene expression and inhibition of adi-pogenic gene expression in bone marrow mesen-chymal stem cells was partially blocked by PNU-74654Note:***.P<0.001.

2.7淫羊藿苷調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂分化 為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同濃度的淫羊藿苷是通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路干預(yù)MSCs成骨分化或者成脂分化。用Wnt/β-catenin信號(hào)通路特異性小分子抑制劑PNU-74654(10 μmol/L)給藥處理MSCs。在淫羊藿苷刺激誘導(dǎo)MSCs之前，PNU-74654預(yù)先給藥處理0.5 h，緊接著10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷刺激MSCs 3 d，隨后使用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)成骨基因RUNX2、ALP和OPN和成脂基因PPARγ、Adipsin和FABP4的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度淫羊藿苷對(duì)MSCs的成骨和成脂分化干預(yù)效應(yīng)均被PNU-74654部分阻斷，見(jiàn)圖7。說(shuō)明淫羊藿苷是通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路干預(yù)MSCs成骨分化或者成脂分化的。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多分化的潛力，可以在一定條件誘導(dǎo)下定向分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及肝細(xì)胞等[8]，針對(duì)人體老齡化主要疾病——骨質(zhì)疏松癥具有潛在的治療價(jià)值，MSCs經(jīng)過(guò)特異性條件刺激可以誘導(dǎo)其向成骨或者成脂方向分化。傳統(tǒng)中醫(yī)藥作為豐富的醫(yī)藥寶庫(kù)，對(duì)骨質(zhì)疏松具有很好的治療效果，而淫羊藿苷作為代表性藥物常用于臨床治療骨質(zhì)疏松。淫羊藿又名仙靈脾，是傳統(tǒng)的溫腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨的中藥，已有研究表明淫羊藿總黃酮或黃酮各單體都具有抗骨質(zhì)疏松的作用[9]，但是淫羊藿苷抗骨質(zhì)疏松的作用如何，其發(fā)揮作用的分子機(jī)制都尚不清楚。因此本研究以SD大鼠分離純化的MSCs為研究對(duì)象，不同濃度淫羊藿苷刺激誘導(dǎo)MSCs，觀察其對(duì)MSCs成骨和成脂雙向分化的作用。

本研究首先研究了淫羊藿苷對(duì)MSCs增殖的影響，初步確定淫羊藿苷的作用濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10～40 ng/ml的淫羊藿苷對(duì)MSCs增殖均無(wú)影響，而50 ng/ml 的淫羊藿苷從第3天開(kāi)始顯著抑制MSCs增殖作用。為了研究不同濃度淫羊藿苷對(duì)MSCs成骨和成脂雙向分化干預(yù)的研究，在細(xì)胞增殖結(jié)果的基礎(chǔ)上篩選10 ng/ml和40 ng/ml作為后續(xù)研究中的兩個(gè)不同給藥濃度。有文獻(xiàn)報(bào)道PPARγ、Adipsin和FABP4是成脂特異性基因，其在脂肪形成的過(guò)程中具有重要的作用，通常作為成脂的標(biāo)志蛋白用來(lái)檢測(cè)脂肪的形成和增殖[10]，而RUNX2、ALP和OPN是成骨的重要標(biāo)志蛋白[11]。本研究結(jié)果表明，不同濃度的淫羊藿苷，特別是10 ng/ml的淫羊藿苷抑制了MSCs成脂分化促進(jìn)了成骨，顯著降低了PPARγ、Adipsin和FABP4的表達(dá)，相反促進(jìn)了RUNX2，ALP和OPN基因的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)油紅O染色10 ng/ml的淫羊藿苷顯著抑制了脂滴的形成，茜素紅染色則表明其促進(jìn)了鈣結(jié)節(jié)的形成；而40 ng/ml的淫羊藿苷則表現(xiàn)出了相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其促進(jìn)了MSCs的成脂分化，抑制成骨分化。

有文獻(xiàn)指出Wnt/β-catenin信號(hào)通路在MSCs的增殖和分化過(guò)程中起到重要的作用[12,13]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度淫羊藿苷在刺激MSCs后激活了Wnt/β-catenin信號(hào)通路，提高了其活化標(biāo)志蛋白β-catenin和Wnt7的表達(dá)，而抑制了降解蛋白GSK-3β的表達(dá)，說(shuō)明不論是10 ng/ml還是40 ng/ml淫羊藿苷均可以激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt/β-catenin通路抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路特異性小分子抑制劑PNU-74654阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，淫羊藿苷對(duì)MSCs的成骨和成脂分化干預(yù)均被顯著阻斷，但不能夠完全阻斷。本研究結(jié)果中，10 ng/ml和40 ng/ml淫羊藿苷均可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，但是卻誘導(dǎo)MSCs出現(xiàn)相反的分化方向，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的具體機(jī)制又如何，這將是我們下一步的研究重點(diǎn)。