邴小三 望燕妮 趙 申 肖惠玲 黃亞萍

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫(yī)院兒科，襄陽 441000)

缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)是圍產(chǎn)期常見的腦損傷形式，是導致新生兒和兒童死亡的主要原因，也可導致終身的神經(jīng)功能損害，如認知和記憶障礙、腦癱和癲癇等[1,2]。新生兒窒息是導致HIBI最常見的原因，它導致了臟器的缺血和再灌注行為，從而致使機體重要器官發(fā)生缺氧缺血性損傷[3]。缺氧缺血引發(fā)的炎癥是導致大腦損傷的關鍵因素，增加了后期神經(jīng)疾病的發(fā)病風險，因此，減輕炎癥對大腦的病理損傷成為改善HIBI的方法之一[4]。大黃(Rhubarb)具有廣泛的生物學活性，包括治療發(fā)熱、腹瀉和中毒，蒽醌類化合物是其主要活性成分，大黃酚(Chrysophanol,CP)是蒽醌類化合物的一種，已被證實具有多種功能，包括抗氧化應激、神經(jīng)保護、抗癌等，而大黃酚發(fā)揮生物活性與其強大的抗炎作用相關[5-10]。但尚未見大黃酚對HIBI中炎癥水平的作用報道，因此，本文采用改良的Rice法建立HIBI新生大鼠模型，研究大黃酚對模型大鼠腦組織病理損傷和炎癥反應的調(diào)節(jié)作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 大黃酚(純度≥98 %，貨號：01542)購自美國SIGMA公司；尼莫地平(30 mg/片，國藥準字H37022796，批號：20171026)購自天津市中央藥業(yè)有限公司；雷帕霉素(Rapamycin,RAP)(貨號：S1039)購自Selleck公司；LC3Ⅱ、Beclin1、P62/SQSTM1、Bcl-2、Bax、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K和β-actin抗體(貨號：bs-2912R、bs-1353R、bs-2951R、bs-4563R、bs-0127R、bs-3495R、bs-1992R、bs-1426R和bs-0061R)購自北京博奧森生物技術有限公司；TNF-α、 IL-4、IL-10和iNOS試劑盒(貨號：F26260、F3742、F3745和F01544)購自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器 QuantStudio3熒光定量PCR儀，美國ThermoFisher公司(美國)；SMART行為視頻記錄和分析系統(tǒng)，東樂自然基因生命科學公司(西班牙)；ChemiDoc XRS化學發(fā)光成像系統(tǒng)，美國伯樂公司(美國)；CX31光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司(日本)；Thermo 900超低溫冰箱，美國Thermo公司(美國)；ELx800全自動酶標儀，美國Bio-Tek儀器有限公司(美國)。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組 7日齡清潔級SD大鼠，體質(zhì)量(17.3±1.9)g，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SCXK (京) 2014-0001，每籠10只飼養(yǎng)于標準籠內(nèi)，由親代大鼠喂養(yǎng)，親代大鼠自由采食和飲水，飼養(yǎng)溫度26℃～28℃，濕度60%～80%，光照12 h/12 h。

分組情況：①檢測腦組織含水量、HE染色、炎癥因子和蛋白表達，大鼠隨機分為6組：假手術組(Sham)、模型組(HIBI)、尼莫地平(nimodipine,NIM)模型組(HIBI+NIM)、模型給藥組(HIBI+CP 2.5、5、10)[11,12]，每組12只。②檢測學習和記憶能力，大鼠隨機分為6組：假手術組(Sham)、模型組(HIBI)、RAP模型組(HIBI+RAP)、模型給藥組(HIBI+CP)[6]，每組6只。

1.2.2HIBI模型制備 造模前大鼠禁食12 h，但不禁水。采用改良的Rice法造模[13]，簡而言之：大鼠麻醉后，仰臥固定，消毒后于頸正中切口，分離暴露頸總動脈，作雙重結扎，縫合皮膚。術后恢復3 h，將大鼠置于含8%氧氣和92%氮氣的自制缺氧箱中，氣體流量保持1 L/min，缺氧2 h。假手術組除不結扎動脈和進缺氧箱中外，其余操作相同。模型大鼠缺氧處理后，大鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸加快、震顫、不愿活動，旋轉(zhuǎn)等行為，假手術組大鼠行為無明顯異常。

1.2.3給藥方法 將NIM配制成10 mg/ml的甲醇儲備液，CP配制成50 mg/ml的生理鹽水儲存液，RAP配制成0.5 mg/ml的DMSO儲備液，實驗時根據(jù)需要進行稀釋。①HIBI+NIM組灌胃給予10 ml/kg NIM(10 mg/kg)[14]、HIBI+CP組腹腔注射給予CP(2.5、5和10 mg/kg)溶液，Sham組和HIBI組腹腔注射給予10 ml/kg生理鹽水。文獻報道，HIBI誘發(fā)的腦水腫常發(fā)生在早期[15]，本文擬檢測造模24 h時的腦水腫程度，因此設計給藥時間為：造模后立即、8 h和16 h，共給藥3次。②HIBI+RAP組和HIBI+CP組分別腹腔注射給予0.5 mg/kg的RAP溶液和2.5、5和10 mg/kg的CP溶液10 ml/kg，Sham和HIBI組腹腔注射給予10 ml/kg生理鹽水。給藥時間[6,16]：造模后立即給藥記為day 1，以后每天1次，直至day 28。

1.2.4腦組織含水量檢測 造模完成后24 h，每組取6只大鼠斷頭處死，取腦。采用干濕重法檢測大鼠腦組織含水量。稱取右腦重量(濕重)，之后將其放入

1.2.5HE染色檢測大鼠腦組織病理改變 造模完成后24 h，每組取6只大鼠，麻醉后打開胸腔，用生理鹽水充分灌洗心臟直至液體澄清，再用4%中性福爾馬林繼續(xù)灌注，后迅速取出腦組織，放入4 %中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片后，行HE染色，于光學顯微鏡下觀察腦組織病理改變。

1.2.6ELISA檢測腦組織中炎癥因子含量 造模完成后24 h，每組取6只大鼠，斷頭處死并摘取腦組織，-80℃保存?zhèn)溆谩７Q取適量腦組織，加入9倍量的預冷生理鹽水，制成10%勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清。嚴格按照試劑盒說明書測定TNF-α、iNOS、IL-6和IL-10，設置3個復孔。

1.2.7Western blot法檢測相關蛋白表達水平 取1.2.6所述大鼠腦組織適量，等比例加入含蛋白抑制劑的裂解液，提取大鼠腦組織總蛋白。用BCA法進行蛋白定量，取樣進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，洗膜，次日加入辣根過氧化物酶標記的相應二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗膜，滴加ECL發(fā)光液，于凝膠成像儀上曝光顯影，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.2.8Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習和記憶能力 自造模后第25天開始為期3天的實驗訓練，每天訓練4次。定位航行實驗：平臺固定于某一象限，水面高于平臺1 cm，溫度設為25℃。將大鼠面向水池壁從四個象限放入水池，由采集系統(tǒng)記錄大鼠的運動情況，自入水開始計時，大鼠找到平臺后，此時間為潛伏期，之后可在平臺上停留10 s；若60 s仍未找到平臺，則記錄為60 s，并將大鼠引至平臺停留10 s。從四個象限放入水池為一次訓練，兩次訓練間隔時間在30 s以上。正式試驗在造模后第28天進行。空間探索實驗：定位航行實驗完成結束后，撤除平臺，從相同象限將大鼠放入水池，記錄60 s 內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)。

2 結果

2.1大黃酚對HIBI大鼠腦組織含水量和病理學改變的影響 采用結扎頸總動脈結合低氧環(huán)境法建立HIBI新生大鼠模型，術后24 h檢測大鼠腦組織含水量，結果如圖1A所示：HIBI組大鼠腦組織含水量顯著高于Sham組(P<0.01)；與HIBI組相比，HIBI+NIM組和HIBI+CP各劑量組大鼠腦組織含水量均降低(P<0.05或P<0.01)。另外，術后24 h進行HE染色檢測大鼠腦組織病理損傷，結果如圖1B所示：Sham組大鼠腦組織結構清楚，神經(jīng)元細胞形態(tài)、數(shù)量正常、排列緊密有序，未見明顯病理改變。HIBI組大鼠腦組織正常結構被破壞，神經(jīng)元細胞出現(xiàn)空泡、腫脹變性甚至壞死，排列紊亂稀疏，并伴有炎性細胞浸潤。HIBI+NIM組、HIBI+CP (5 mg) 組和HIBI+CP (10 mg)組大鼠腦組織上述病理改變均得到不同程度的改善。

2.2大黃酚對HIBI大鼠腦組織炎性細胞因子含量的影響 ELISA檢測大鼠腦組織中炎性細胞因子表達，結果如圖2所示：與Sham組相比，HIBI組大鼠腦組織中TNF-α、iNOS和IL-6炎癥細胞因子含量增加(P<0.01)，抗炎因子IL-10含量降低(P<0.01)；但經(jīng)NIM和CP治療后，TNF-α、iNOS和IL-6表達水平顯著低于HIBI組(P<0.01)，IL-10則高于HIBI組(P<0.01)。

2.3大黃酚對HIBI大鼠腦組織自噬蛋白表達水平的影響 造模后24 h，蛋白印跡檢測大鼠腦組織中自噬標記蛋白的表達水平，結果如圖3所示：HIBI組大鼠腦組織中LC3II/LC3I比值、Beclin1和Bax蛋白表達顯著高于Sham組(P<0.01)，P62/SQSTM1比值和Bcl-2蛋白表達則顯著低于Sham組(P<0.01)；與HIBI組相比，HIBI+NIM組和HIBI+CP各劑量組大鼠腦組織中上述蛋白表達水平均得到逆轉(zhuǎn)(P<0.05或P<0.01)。

圖1 大黃酚對HIBI大鼠腦組織含水量和病理學改變的影響Fig.1 Effects of chrysophanol on cerebral water content and pathological changes in HIBI ratsNote:A.The water content of brain tissue was detected by dry-wet weight method;B.The pathological damage of brain tissue was detected by HE staining (×400).**.P<0.01 versus Sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus HIBI group,n=6.

圖2 大黃酚對HIBI大鼠腦組織炎癥因子含量的影響Fig.2 Effects of chrysophanol on content of inflammatory factors in brain tissue of HIBI ratsNote:The levels of inflammatory factors in rat brain tissue were detected by ELISA.**.P<0.01 versus Sham group;##.P<0.01 versus HIBI group,n=6.

圖3 大黃酚對HIBI大鼠腦組織自噬蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of chrysophanol on expression of autophagic protein in brain tissue of HIBI ratsNote:Protein expression levels were detected by Western blot.**.P<0.01 versus Sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus HIBI group,n=6.

圖4 大黃酚對HIBI大鼠腦組織mTOR/p70S6K信號通路磷酸化的影響Fig.4 Effects of chrysophanol on phosphorylation of mTOR/p70S6K signaling pathway in brain tissue of HIBI ratsNote:Protein expression levels were detected by Western blot.**.P<0.01 versus Sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 versus HIBI group,n=6.

圖5 大黃酚對HIBI大鼠學習和記憶能力的影響Fig.5 Effects of chrysophanol on learning and memory ability in HIBI ratsNote:A.Escape latency;B.Number of crossing platforms.**.P<0.01 versus Sham group;##.P<0.01 versus HIBI group,n=6.

2.4大黃酚對HIBI大鼠腦組織mTOR/p70S6K信號通路磷酸化的影響 造模后24 h，蛋白印跡檢測大鼠腦組織mTOR/p70S6K信號通路激活情況，結果如圖4所示：HIBI組p-mTOR/mTOR和p-p70S6K/p70S6K顯著低于Sham組(P<0.01)；HIBI+NIM組和HIBI+CP各劑量組大鼠腦組織中mTOR/p70S6K信號通路磷酸化水平均高于HIBI組(P<0.05或P<0.01)。

2.5大黃酚對HIBI大鼠學習和記憶能力的影響 Morris水迷宮實驗檢測造模后第28天時大鼠的學習和記憶能力，結果如圖5所示：與Sham組相比，HIBI組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，而穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.01)；自噬激活劑雷帕霉素治療組(HIBI+RAP)大鼠逃避潛伏期較HIBI組延長(P<0.01)，穿越平臺次數(shù)較HIBI組減少(P<0.01)；而大黃酚治療組(HIBI+CP) 大鼠逃避潛伏期較HIBI組也延長(P<0.01)，穿越平臺次數(shù)較HIBI組也減少(P<0.01)。

3 討論

HIBI 是新生兒最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是新生兒死亡的主要原因，尋找有效的預防或治療方式是非常迫切的要求。建立HIBI模型是研究的基礎，目前造模方法較多，包括亞硝酸鈉法、靜脈注射氯化鎂法等[17]，但經(jīng)典Rice法卻是近年來研究HIBI的最常用建模方法。研究表明，腦組織水腫和壞死是缺氧缺血性腦病(Hypoxic-ischemic encephalo-pathy,HIE)的早期病理變化，也是導致病情惡化的重要因素[18，19]。尼莫地平是一種電壓依賴性、選擇性的二氫吡啶型(L型)Ca2+通道的親脂拮抗劑，它能穿過心腦屏障，引起腦血管擴張，3周齡高嶺土誘導的腦積水大鼠連續(xù)給藥尼莫地平兩周，能有效改善大鼠行為學和腦組織結構完整性[20]。因此，本文根據(jù)文獻[14]選擇尼莫地平作為陽性藥，10 mg/kg為給藥劑量，且保留尼莫地平給藥途徑(灌胃給藥)；但因大黃酚在治療腦組織相關疾病時多采用腹腔給藥方式[12,21]，故本文也沿用此方式，這可能與大黃酚的理化性質(zhì)有關。本文研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織含水量顯著增加，且HE染色也直觀的表明，模型大鼠腦組織發(fā)生了早期的組織水腫和病理性壞死，與上述文獻報道的HIBI病理變化一致。綜合實驗結果證明，本實驗中HIBI模型建立成功。此外，經(jīng)造模后立即、8 h和16 h的3次給藥后發(fā)現(xiàn)，10 mg/kg劑量的大黃酚能有效改善HIBI造模引起的新生大鼠腦組織水腫程度，減輕腦神經(jīng)元細胞發(fā)生空泡化、壞死及炎癥浸潤等病理改變，且可能與改變腦組織血管通透性有關。

TNF-α和IL-6等是HIBI誘導的炎癥反應早期的炎性細胞因子，在HIBI病理損傷中發(fā)揮著重要作用[22]，TNF-α是全身炎癥反應的初始物質(zhì)，能促進IL-6和IL-1等因子釋放，導致炎性損傷的級聯(lián)反應[23]。為了證明HIBI導致了新生大鼠腦組織發(fā)生炎癥反應，本文采用ELISA方法檢測各組大鼠腦組織勻漿中炎癥因子表達的水平差異，結果發(fā)現(xiàn)，在HIBI模型大鼠腦組織中TNF-α、iNOS、IL-6炎癥因子存在高表達和抗氧因子IL-10的低表達，而大黃酚有效調(diào)節(jié)了上述炎癥因子在HIBI大鼠腦組織的表達水平，從而有利于減輕炎癥造成的腦組織損傷。

自噬水平對維持細胞穩(wěn)態(tài)必不可少，但自噬的異常激活常對細胞產(chǎn)生負面影響。研究表明，在HIBI新生大鼠模型中，自噬通常表現(xiàn)被過度激活[2,16]，從而消耗選擇性底物SQSTM1(Sequesto-some1)，即在細胞內(nèi)的SQSTM1水平受到自噬水平的調(diào)節(jié)，且蛋白表達水平與細胞自噬呈負相關[24]。而Bcl-2可與Beclin1結合降低自噬水平，進而減少缺氧引起的腦組織損傷[25]。本文研究也證實，自噬標記蛋白LC3II/LCI、Beclin1和Bax在HIBI模型中高表達，p62/SQSTM1和Bcl-2則表達減少，與上述研究結果一致。此外，大黃酚治療能負向調(diào)節(jié)上述蛋白在HIBI模型大鼠腦組織的表達水平，進而有效降低腦組織的異常自噬水平，從而降低腦組織損傷。

mTOR是靶向哺乳動物細胞中重要的信號調(diào)節(jié)因子，參與機體多種細胞生物學，包括自噬、細胞周期和代謝等[26]，mTOR表達異常與多種疾病進程相關，而激活其下游p70S6K靶點是自噬的必要途徑[24]。Wang等[16]認為，新生兒時期經(jīng)歷HIBI可能導致青少年時期的學習和記憶能力的損傷，雷帕霉素作為mTOR信號激活劑加劇了腦神經(jīng)損傷，具體表現(xiàn)為空間學習和記憶能力的下降。提示，自噬抑制可能是減輕腦組織損傷，改善后期空間學習和記憶能力的有效途徑。為了明確mTOR/p70S6K信號通路在HIBI模型新生大鼠腦組織的表達情況，本文通過蛋白印跡實驗檢測了該通路磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)，HIBI模型大鼠低表達p-mTOR和p-p70S6K，大黃酚能上調(diào)兩者的蛋白表達。實驗結果證明，大黃酚能通過抑制mTOR/p70S6K信號通路磷酸化激活而降低HIBI模型大鼠的自噬水平。此外，本文通過Morris水迷宮實驗檢測HIBI對新生大鼠的學習和記憶能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)大黃酚改善了mTOR特異性自噬激活劑對HIBI造成的學習和記憶能力下降。綜合實驗結果證明，大黃酚對HIBI模型大鼠腦組織的損傷保護作用與增加mTOR/p70S6K信號通路活化有關。

本文研究表明，在HIBI新生大鼠模型中，大黃酚成功降低了模型大鼠腦組織含水量，減輕了腦組織病理損傷，調(diào)節(jié)腦組織中炎性細胞因子水平和自噬相關蛋白表達水平，且能逆轉(zhuǎn)自噬激活劑對模型大鼠學習和記憶能力的影響。綜上所述，大黃酚能改善HIBI新生大鼠腦組織病理損傷并降低腦組織炎癥反應，其機制可能與降低腦組織過度自噬有關。這為大黃酚在HIBI的臨床治療上提供了一定的實驗數(shù)據(jù)。