王金蓮 陳 路 余孟英 何江濤

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科,南充 637000)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨癌之一，在患者中表現(xiàn)為成骨細胞分化癌和惡性骨樣癌，常見于兒童和青少年[1]。骨肉瘤屬于遺傳不穩(wěn)定且高度惡性的骨間充質腫瘤，其特征在于染色體結構改變。目前，治療骨肉瘤通常采用化療和放射療法進行治療和預防腫瘤擴散，由于骨肉瘤患者對化療的抵抗力、預后不良、遠處轉移等原因，患者5年生存率約為20%[2]。由于經傳統(tǒng)外科手術、新輔助化療后患者生活質量降低、腫瘤易復發(fā)等情況，骨肉瘤的治療進展緩慢[3]，因此，探尋用于骨肉瘤的新型有效療法十分迫切。鳶尾黃素(Tectorigenin，TEC)是從射干[Belamcanda chinensis(L.)Redouté]中提取的一種有效成分,是一種天然的異黃酮。鳶尾黃素具有抗炎、抗增殖、抗氧化活性等多種藥理作用[4]，結構圖如圖1所示。鳶尾黃素已被發(fā)現(xiàn)對乳腺癌、肺癌、睪丸癌、肝細胞癌、前列腺癌和白血病具有治療作用。已有研究表明鳶尾黃素可以抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲[5]。本文旨在研究鳶尾黃素對MG63骨肉瘤細胞凋亡和自噬作用的影響。

圖1 鳶尾黃素化學結構Fig.1 Chemical structure of Tectorigenin

1 材料與方法

1.1材料 鳶尾黃素(67359)購自美國Sigma-Aldrich,化學式：C16H12O6，分子量：300.26。Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI1640)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液購自美國Gibco公司。MTT檢測試劑盒、Hoechst雙染試劑盒購自南京建成生物工程研究所?？笲eclin-1、p62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、cleaved caspase-3、Pl3K、AKT、mTOR購自美國Abcam公司。Bax、Bcl-2、GAPDH購自Santa cruz。BCA蛋白濃度測定試劑盒、免疫熒光染色試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人成骨肉瘤MG63細胞來源于上海中科院細胞庫，將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液每2 d更換1次，每3 d進行一次傳代，實驗用細胞為對數(shù)生長期細胞。

1.2.2MTT檢測細胞活力 在96孔板中加入細胞100 μl/孔，再加入不同劑量的鳶尾苷(0、10、50、100、200、400 μmol/L)，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入50 μl 1×MTT溶液，孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標儀在570 nm處檢測各劑量OD值。

1.2.3細胞分組 取實驗待用細胞分為空白對照(Negative control，NC)組、阿霉素(Adriamycin，ADR)組、50 μmol/L TEC組、100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組檢測凋亡和自噬；NC組、50 μmol/L TEC組、100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組檢測PI3K/AKT/mTOR通路。

1.2.4Hoechst 離心收集人成骨肉瘤MG63細胞105個懸浮于1 ml培養(yǎng)基中，加入10 μl Hoec-hst33342染液，混勻，37℃孵育10 min，1 000 r/min離心5 min棄去上清液，加入1 ml Buffer A工作液懸浮細胞，加入5 μl PI染液，孵育10 min后混勻，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5免疫熒光檢測 將細胞接種于細胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，吸掉封閉液，加入一抗，孵育過夜，PBS浸洗，避光加入熒光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.6Western blot 首先將各組待測細胞用PBS清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質含量；提取等量的蛋白質樣品(20 mg)，在100℃條件下變性5 min。然后使用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，在4℃條件條件下加入相應一抗并孵育過夜，清洗，然后在4℃條件下加入辣根過氧化物酶標記的二抗，孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

2 結果

2.1鳶尾黃素降低細胞活力 采用MTT試劑盒檢測不同劑量鳶尾黃素對MG63細胞活力的影響，如圖2所示，TEC 10 μmol/L細胞活力與TEC 0 μmol/L相比無顯著差異(P>0.05)。TEC 50、100、200、400 μmol/L 細胞活力均顯著低于TEC 0 μmol/L(P<0.05)，且以劑量依賴的方式降低。說明鳶尾苷具有抑制MG63骨肉瘤細胞活力的作用。

2.2鳶尾黃素促進細胞凋亡 采用Hoechst染色檢測MG63細胞凋亡情況，結果如圖3A、B所示，凋亡細胞的細胞核呈亮藍色，即以亮藍色斑點密度代表細胞凋亡程度。ADR組細胞凋亡率極顯著高于NC組(P<0.01)，50、100、200 μmol/L TEC組細胞凋亡率均顯著高于NC組(P<0.05)，且以劑量依賴的方式凋亡率依次升高。蛋白免疫印跡試劑盒檢測BAX、Bcl-2、cleaved caspase-3表達，結果如圖3C、D所示，NC組BAX/Bcl-2表達極顯著低于ADR組(P<0.01)，50 μmol/L TEC組BAX/Bcl-2表達較NC組無顯著差異(P>0.05)，100 μmol/L TEC組BAX/Bcl-2表達顯著高于NC組(P<0.05)，200 μmol/L TEC組BAX/Bcl-2表達極顯著高于NC組(P<0.01)；ADR組cleaved caspase-3表達極顯著高于NC組(P<0.01)，50 μmol/L TEC組cleaved caspase-3表達較NC組無顯著差異(P>0.05)，100、200 μmol/L TEC組cleaved caspase-3表達顯著高于NC組(P<0.05)。

圖2 鳶尾黃素降低細胞活力Fig.2 TEC reduces cell viabilityNote:*.P<0.05.

2.3鳶尾黃素促進細胞自噬 采用免疫熒光檢測自噬體形成情況以及Western blot檢測Beclin-1、P62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達水平，免疫熒光觀察到ADR、50 μmol/L TEC、100 μmol/L TEC、200 μmol/L TEC組均有自噬顆粒聚集(圖4A)，ADR組、100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組自噬體數(shù)極顯著高于NC組(P<0.01，圖4B)。檢測Beclin-1、P62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ表達如圖4C、D所示。ADR組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達極顯著高于NC組(P<0.01)，100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達顯著高于NC組(P<0.05)，NC組Beclin-1蛋白表達極顯著低于ADR組(P<0.01)，顯著低于100 μmol/L TEC組、200 μmol/L TEC組(P<0.05)。ADR組P62蛋白表達極顯著低于NC組(P<0.01)，ADR組P62蛋白表達顯著高于100 μmol/L TEC組和200 μmol/L TEC組(P<0.05)。

2.4鳶尾黃素抑制PI3K/AKT/mTOR通路 Western blot檢測總PI3K、AKT、mTOR,磷酸化PI3K、AKT、mTOR蛋白的表達，如圖5所示，NC組p-PI3K/PI3K水平顯著高于50、100、200 μmol/L TEC組(P<0.05)，50、100、200 μmol/L TEC組p-AKT/AKT水平顯著低于NC組(P<0.05)。100 μmol/L TEC、200 μmol/L TEC組p-mTOR/mTOR水平顯著低于NC組(P<0.05)。說明鳶尾苷以劑量依賴的方式抑制PI3K/AKT/mTOR通路。

圖3 鳶尾黃素促進細胞凋亡Fig.3 TEC promotes apoptosisNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

圖4 鳶尾黃素促進細胞自噬(×400)Fig.4 TEC promotes autophagy(×400)Note:*.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 鳶尾黃素抑制PI3K/AKT/mTOR通路Fig.5 TEC inhibits PI3K/AKT/mTOR pathwayNote:*.P<0.05.

3 討論

骨肉瘤是一種罕見的間充質腫瘤，其典型組織學特征為重度非典型性和多形性，瘤細胞大小不等，形態(tài)不一，可呈上皮樣、漿細胞樣、短梭形或梭形，腫瘤細胞直接產生骨樣基質，伴有不同程度的鈣化，可有或無高級別軟骨肉瘤成分，通常出現(xiàn)在生命的第一個或第二個十年，不幸的是，骨肉瘤患者的臨床結果在最近30多年內沒有顯著改善[6]。治療進展的停滯可能是由這種罕見腫瘤的遺傳、表觀遺傳和生物復雜性導致的，骨肉瘤治療的挑戰(zhàn)在于一個腫瘤到另一個腫瘤的極端變異，使得單一目標方法不可能解決所有患者甚至大多數(shù)患者[7]。骨肉瘤的預后不良是由于其轉移和化療耐藥率高，已有研究顯示對骨肉瘤活性化療耐藥的藥物包括順鉑、阿霉素和高劑量甲氨蝶呤[8]。迄今為止，現(xiàn)代多藥物化學療法可使總體存活率得到最大改善，并且除了常規(guī)治療之外，未來采用組合靶向化療可能是改善存活率的有效手段。

據(jù)報道，惡性腫瘤的流行病學發(fā)病率被認為與植物雌激素的豐度有關[9]，由于人們知識的普及使植物雌激素成為治療腫瘤的潛在藥物和支持藥物，例如絕經后婦女采用雌激素替代療法，減少更年期癥狀和預防骨質疏松癥及心血管疾病[10]。射干是一種傳統(tǒng)中藥，具有清熱、解毒、祛痰、消炎鎮(zhèn)痛的作用[11]，到目前為止，已經從中鑒定了幾種植物雌激素，其中鳶尾黃素的抗癌作用已經在不同類型的癌癥和細胞系中顯示出來，Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃素對白血病HL-60細胞分化具有抑制作用。Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃素對人肝細胞癌HepG2具有促凋亡作用。因此，鳶尾黃素可能有助于治療骨肉瘤。

細胞凋亡是進化上的保守過程，在生物體發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用。然而，在病理條件下，尤其是癌癥中，細胞喪失凋亡誘導細胞有序死亡的能力，導致細胞不受控制的增殖。經常發(fā)現(xiàn)癌細胞過度表達許多蛋白質，這些蛋白質在抵抗凋亡級聯(lián)的激活中起重要作用，其中之一是抗凋亡分子的過表達。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗凋亡家族和促凋亡Bax蛋白是細胞凋亡的關鍵調節(jié)因子，Bax/Bcl-2的比例決定了細胞的命運[14]。cleaved caspase-3是凋亡核心蛋白caspase-3活化時經剪切產生的活性片段，是有活性的caspase-3，其表達程度可反映caspase-3的活性狀態(tài)和細胞凋亡的大致情況。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷通過上調Bax/Bcl-2的比例來促進骨肉瘤細胞凋亡，并通過減弱人骨肉瘤細胞中β-連環(huán)蛋白信號來抑制增殖。Cheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸十二酯通過上調caspase依賴的凋亡途徑和抑制人骨肉瘤細胞中Bcl-2家族蛋白的表達誘導細胞凋亡。本研究結果與上述研究結果一致，鳶尾黃素可以通過上調Bax/Bcl-2的比例和cleaved caspase-3的表達抑制人骨肉瘤細胞凋亡。

自噬是一種必不可少且高度保守的細胞過程，其針對未使用的蛋白質和受損細胞的細胞器進行內部消化[17]。自噬可以在凋亡缺陷細胞中起到替代細胞死亡機制，通過這種機制，可以抑制腫瘤[18]，矛盾的是，自噬也可被確定為細胞存活機制，誘導細胞存活的自噬可抑制細胞的抗癌活性[19]。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)鳶尾黃素可以通過促進肝細胞自噬防止爆發(fā)性肝衰竭。本研究表明，自噬基因Beclin-1以劑量依賴的方式上調表達，上調LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,下調P62水平，說明鳶尾黃素以劑量依賴的方式促進MG63骨肉瘤細胞自噬。

PI3K/AKT/mTOR通路可以調節(jié)細胞增殖、細胞凋亡抗性和腫瘤發(fā)生[21]。PI3K/Akt/mTOR信號傳導也被認為是一種典型的自噬信號傳導途徑，它將信號從細胞膜傳遞到細胞核并激活多種細胞事件[22]，PI3K激活Akt的磷酸化，然后激活mTOR以最終觸發(fā)自噬的抑制。Sun等[23]研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素異黃酮的毛蕊花素通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導MG63骨肉瘤細胞凋亡。Yin等[24]研究發(fā)現(xiàn)miR-155通過靶向PI3K和Rheb下調PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性，以促進ox-LDL誘導的HUVEC中的自噬。在本實驗中，在鳶尾黃素處理后，MG63骨肉瘤細胞中PI3K、AKT和mTOR的表達水平下調,暗示鳶尾黃素抑制PI3K/AKT/mTOR通路促進MG63骨肉瘤細胞凋亡和自噬。

總的來說，本文揭示了鳶尾黃素對MG63骨肉瘤細胞凋亡和自噬作用的影響：鳶尾黃素降低MG63骨肉瘤細胞活力，以劑量依賴的方式促進MG63骨肉瘤細胞的凋亡和自噬，這作用可能是通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路來實現(xiàn)的。本研究結果闡明了鳶尾黃素治療骨肉瘤的潛力。