賈雪冰 李琦

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別位居第6 位和第3位［1-2］。在分子機(jī)制方面，肝癌進(jìn)展相關(guān)基因的作用往往取決于其蛋白產(chǎn)物水平及翻譯后修飾，如泛素化、磷酸化和乙?；?。因此，探索這些基因在蛋白水平上的調(diào)控機(jī)制對于肝癌的分子靶向治療具有重要的理論價值。

泛素蛋白酶體途徑是由調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)定和降解的泛素化和去泛素化組成的高度動態(tài)過程。去泛素化酶參與去泛素化的機(jī)制錯綜復(fù)雜，不僅能解除泛素化，而且可以通過再循環(huán)泛素分子、校對泛素化進(jìn)程、分解泛素化抑制因子等方式促進(jìn)泛素化過程［3］，其異?；顒涌赡芘c癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，有關(guān)去泛素化酶與肝癌發(fā)生機(jī)制有一些新的研究。本文將對在肝癌中發(fā)揮作用的去泛素化酶及去泛素化酶抑制劑的研究新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 去泛素化酶家族及其作用

1.1 去泛素化酶家族的組成

目前，已發(fā)現(xiàn)的去泛素化酶約有99種，根據(jù)去泛素化酶活性部位不同可以將其分為7大家族，分別是泛素特異性蛋白酶家族（ubiquitin-specific proteases，USPs）、泛素羧基末端水解酶家族（ubiquitin C-terminal hydrolases，UCHs）、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶家族（ovarian tumor-related proteases，OTUs）、MJD 結(jié)構(gòu)域蛋白酶家族（Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs/Josephins）、含JAB1/PAB1/MPN 結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶家族（JAB1/PAB1/MPN domain-containing metallo-enzymes，JAMMs）和單核細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)的蛋白酶家族（mococyte chemotactic proteininduced protein，MCPIPs）以及最近發(fā)現(xiàn)的鋅指含泛素肽 酶1（zinc finger containing ubiquitin peptidase 1，ZUP1）。7個家族中除了JAMMs（也稱為MPN）家族，其他6 個被歸類為半胱氨酸蛋白酶，而JAMMs 家族由鋅依賴金屬蛋白酶組成。USP 家族是目前已知去泛素化酶家族中成員最多、結(jié)構(gòu)最具多樣性的一類。除了MJDs，每個家族的基因在酵母和人類中都是高度保守的。在去泛素化酶的99 個家族成員中，有11個由于失去了去泛素化活性的關(guān)鍵殘基而被認(rèn)為是假酶，但它們?nèi)匀豢梢酝ㄟ^變構(gòu)激活具有催化活性的去泛素化酶和其它活性酶而發(fā)揮重要的生物學(xué)作用［4］。

1.2 去泛素化酶的功能

泛素化和去泛素化之間的平衡與蛋白質(zhì)水平和活性的調(diào)控密切相關(guān)。去泛素化酶是作用于泛素分子之間或泛素與被修飾蛋白質(zhì)之間的肽或異肽鍵的蛋白酶。去泛素化酶以兩種完全不同的方式處理泛素修飾：1）通過不同催化域的蛋白質(zhì)相互作用而定向于特定的蛋白質(zhì)底物［5］；2）識別和選擇特定的泛素鏈結(jié)構(gòu)［6］。去泛素化酶具有以下功能：1）維持游離泛素水平，即將泛素分子從泛素化的蛋白底物上游離出來；2）從任何泛素介導(dǎo)的降解途徑（蛋白酶體、內(nèi)泌體和自噬體）中解離蛋白質(zhì)，防止其降解；3）控制泛素介導(dǎo)的后續(xù)生理活動的啟動［5］。去泛素化酶通過逆轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)泛素化降解過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用、定位和酶活性，影響細(xì)胞過程，包括轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷信號和DNA 修復(fù)、細(xì)胞周期進(jìn)展、內(nèi)吞作用、細(xì)胞凋亡等［7］。隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)抑制去泛素化酶活性可能成為一種新的腫瘤治療方法，如可以調(diào)節(jié)各種癌基因或腫瘤抑制基因蛋白水平或活性的USP7 和USP28 等，以及與促進(jìn)腫瘤生長的關(guān)鍵表觀遺傳變化有關(guān)的USP22等［8］。由此可見，DUBs可能成為腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)。

2 去泛素化酶在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用

目前，有關(guān)去泛素化在肝癌中作用的研究不多，僅涉及USPs 家族（包括屬于USPs 亞家族的CYLD）。其中，研究較多的有USP22、USP7 和CYLD 等。USP的結(jié)構(gòu)域高度保守，包括3 個亞結(jié)構(gòu)域：Finger、Thumb 和Palm［9］，大多數(shù)USP 蛋白含有1 個催化區(qū)域和與其它蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。CYLD缺乏Finger亞結(jié)構(gòu)域，它是一個與腫瘤綜合征相關(guān)的去泛素化酶。泛素的C-端插入到USP 介于Thumb 和Palm 亞結(jié)構(gòu)域之中，而泛素的球狀部分則與Finger亞結(jié)構(gòu)域相互作用。USP 家族的成員通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而對肝癌細(xì)胞的生長、增殖、分化及凋亡起重要作用。

2.1 USP22在肝癌中的作用

泛素特異性蛋白酶22（USP22）主要通過去泛素化修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)，在腫瘤發(fā)生、耐藥和細(xì)胞周期等方面發(fā)揮作用。USP22 與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要與BMI-1、MYC、TRF1 等因子有關(guān)，這一特點(diǎn)使其可能成為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一。

2.1.1 USP22促進(jìn)肝癌干細(xì)胞生成 在缺氧條件下，USP22 和TP53 作 為HIF1α 的直接靶基因可以被HIF1α 轉(zhuǎn)錄上調(diào)。在TP53 野生型肝細(xì)胞癌中，TP53能抑制HIF1α誘導(dǎo)的USP22上調(diào)，而HIF1α可以通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)TP53 進(jìn)而促進(jìn)其抑制作用。在TP53 突變的肝癌細(xì)胞中，USP22和HIF1α形成一個正反饋回路并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性。TP53突變且USP22和（或）HIF1α高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者往往預(yù)后較差。同時，靶向USP22 的脂蛋白復(fù)合物能抑制小鼠肝臟腫瘤的發(fā)生并增強(qiáng)索拉非尼的敏感性［10］。綜上，USP22通過TP53失活后的HIF1α/USP22正反饋回路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的肝癌干細(xì)胞生成。因此，USP22有可能成為肝細(xì)胞癌的治療靶標(biāo)。

2.1.2 USP22增強(qiáng)抗腫瘤免疫 PD-1（CD279）-PDL1（CD274）抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對癌癥免疫逃避至關(guān)重要，已成為抗腫瘤免疫治療的主要靶點(diǎn)之一。USP22 可直接與CD274的C端相互作用，誘導(dǎo)其去泛素化和穩(wěn)定。USP22 在肝癌中高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。USP22基因缺失能抑制小鼠肝癌生長，增加腫瘤免疫原性和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，提高CD274 靶向免疫治療和順鉑化療的療效［11］。因此，靶向USP22是增強(qiáng)CD274抗腫瘤免疫的有希望的策略。

2.1.3 USP22 在肝癌耐藥方面發(fā)揮作用 肝細(xì)胞癌的藥物治療常因多藥耐藥（MDR）而失敗，USP22表達(dá)水平是BEL7402 和BEL/FU 細(xì)胞耐藥表型改變的原因。USP22下調(diào)顯著抑制ABCC1（編碼多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1）的表達(dá)，USP22 可以通過激活SIRT1/AKT/MRP1通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞中MDR的表達(dá)［12］。因此，USP22 可能是一個逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的潛在靶點(diǎn)。通過干擾核糖核酸下調(diào)耐藥肝癌細(xì)胞系中USP22 的表達(dá)可導(dǎo)致耐藥基因BMI1 的表達(dá)下降，相應(yīng)地，USP22高表達(dá)可通過上調(diào)BMI1的表達(dá)，在肝癌患者化療藥物耐藥中發(fā)揮重要作用［13］。因此，USP22和BMI1 的共表達(dá)可能成為肝癌預(yù)后的新指標(biāo)，有助于指導(dǎo)臨床治療。USP22 基因被敲低后，通過下調(diào)PI3K 和激活Smad4 來發(fā)揮其功能，而Smad4 可以抑制Akt 的磷酸化。同樣，沉默Smad4 可阻斷敲除USP22 后誘導(dǎo)的Bel/Fu 細(xì)胞中Akt 的抑制，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制體內(nèi)的致瘤和轉(zhuǎn)移能力和耐藥相關(guān)蛋白（MDR1、LRP、MRP1）等［14］。

2.1.4 USP22 在肝癌進(jìn)展中的作用 肝癌組織中USP22和Survivin的表達(dá)與腫瘤的大小、分期、分化等惡性行為密切相關(guān)。敲低USP22 基因可下調(diào)Survivin、Cyclin B的表達(dá)、上調(diào)p21的表達(dá)，這提示USP22 與Survivin 的協(xié)同作用參與HCC 的進(jìn)展［15］。USP22高表達(dá)提示患者預(yù)后較差，總生存率和無復(fù)發(fā)生存率較低。USP22 可作為肝癌獨(dú)立的預(yù)后分子標(biāo)志物［16］。其中關(guān)于USP22的研究相對較多，它在肝癌的耐藥、免疫及癌癥進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，且USP22的特異性抑制劑LY294002已被證明可以抑制癌癥進(jìn)展，但目前鮮見相關(guān)臨床試驗開展。

2.2 USP7在肝癌中的作用

USP7通過去泛素化穩(wěn)定甲狀腺激素受體相互作用蛋白12（TRIP12），使p14（ARF）失活，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。與正常肝組織相比，肝癌組織中USP7的RNA和蛋白表達(dá)水平均有上調(diào)，USP7 高表達(dá)與肝癌患者的惡性表型顯著相關(guān)，包括分期較晚、腫瘤體積大、腫瘤多灶性、分化差、甲胎蛋白升高、微血管侵犯等。此外，USP7和（或）TRIP12高表達(dá)的肝癌患者總生存期短、腫瘤復(fù)發(fā)率高［17］。除了TRIP12，Hippo 通路的關(guān)鍵分子YAP是USP7調(diào)控肝癌的另一個靶點(diǎn)，USP7通過穩(wěn)定YAP促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖［18］。脂肪細(xì)胞分泌的外泌體環(huán)狀RNA 通過抑制miR-34a，激活USP7/Cyclin A2 信號通路，促進(jìn)腫瘤生長，減少DNA損傷［19］。總之，USP7 可增強(qiáng)HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。因此，USP7可作為肝癌患者預(yù)后的標(biāo)志物，也是肝癌潛在的治療靶點(diǎn)。

2.3 CYLD在肝癌中的作用

臨床上，許多肝癌患者常有罹患肝病的病史，如慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等。因此，去泛素化酶與這一動態(tài)過程的關(guān)系不可忽視，如去泛素化酶CYLD 在肝臟脂肪變性和炎癥發(fā)生過程中起重要保護(hù)作用，可防止其進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。在肝臟損傷后，CYLD有助于肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和恢復(fù)，CYLD活性的突變或中斷可加重急性和慢性肝損傷，進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展［20］。CYLD在肝細(xì)胞中的失活會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、炎癥、纖維化和腫瘤發(fā)生。肝臟特異性CYLD通過自發(fā)的慢性激活TGF-β活化激酶1（TAK1）和C-Jun N端激酶（JNK）而阻止肝細(xì)胞程序性死亡，引起肝星狀細(xì)胞和庫普弗細(xì)胞活化，從而促進(jìn)肝細(xì)胞的纖維化、炎癥、腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，以及肝細(xì)胞凋亡向中央靜脈的擴(kuò)張，后期代償性增殖導(dǎo)致癌灶形成［21］。也就是說，去泛素酶CYLD 在肝細(xì)胞中的失活會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)野生型CYLD可抑制細(xì)胞增殖，但不影響細(xì)胞凋亡、黏附和遷移。Pannem 等［22］通過對81例人肝癌組織的免疫組織化學(xué)和組織芯片分析發(fā)現(xiàn)，CYLD的表達(dá)與增殖標(biāo)志物Ki-67和c-MYC的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即CYLD 的下調(diào)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌的侵襲性生長。因此，CYLD可作為肝癌進(jìn)展的潛在標(biāo)志物。

2.4 其他去泛素化酶在肝癌中的作用

USP9 可以被XLNC473 募集來抑制Survivin 的泛素化水平，增加Survivin 的表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程［23］，這與USP22 有著相似的功能。USP39 表達(dá)下調(diào)將細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，從而抑制肝癌細(xì)胞的生長［24］。因此，上調(diào)USP39 表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖［25］。USP4/CypA復(fù)合物通過去泛素化作用抑制CypA在肝癌細(xì)胞中的降解，激活MAPK信號通路，阻止CrkII磷酸化，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲［26］。另外，USP4 通過去泛素化其下游靶分子TAK1，進(jìn)而抑制TAK1激酶活性及下游NF-κB和JNK等通路活性，從而有效改善肝臟細(xì)胞脂肪堆積，防止肝代謝紊亂的進(jìn)一步發(fā)展［27］。USP11 可以促進(jìn)HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲，且與血管侵犯（P=0.033）、分化（P=0.027）、腫瘤數(shù)目（P=0.009）、復(fù)發(fā)（P=0.036）和較短的總生存時間（P=0.001）有關(guān)［28］。其他泛素酶成員如USP5、USP18、USP27、USP30、USP14 等，都是通過作用于其下游靶基因表達(dá)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［29-32］。USP10 在肝癌中發(fā)揮抑癌作用，其通過穩(wěn)定AMPKα 和PTEN 進(jìn)而抑制mTORC1激活，這為臨床上以mTOR信號通路為導(dǎo)向的靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)［33］。在化學(xué)誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，缺乏USP28 的小鼠更容易形成腫瘤，提示USP28 參與肝癌的抑制，并有可能成為肝癌的預(yù)后標(biāo)志物［34］。

3 去泛素化酶抑制劑在肝癌中的研究進(jìn)展

去泛素化酶抑制因子WP1130 聯(lián)合阿霉素治療肝癌，其機(jī)制在于通過促進(jìn)P53的泛素化降解來抑制阿霉素介導(dǎo)的p53 上調(diào)［35］，即WP1130 可以提高阿霉素的化療敏感性，這對于指導(dǎo)臨床化療的聯(lián)合用藥有重要意義。USP7抑制劑P22077可以抑制Huh7和SK-Hep1 等肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，并且在肝癌的異種移植模型中有效的抑制了腫瘤的生長［18，36］。BAP15是泛素特異性肽酶14（USP14）的強(qiáng)效選擇性抑制劑，能顯著降低肝癌細(xì)胞活力，增加細(xì)胞凋亡，并干擾細(xì)胞周期，降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。此外，這種抑制作用呈劑量依賴性。同時，B-AP15 通過增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/UPR和抑制Wnt/Notch1信號通路來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性反應(yīng)［37］。這一新發(fā)現(xiàn)為B-AP15抗腫瘤治療作用提供了新的機(jī)制。USP22通過激活SIRT1/AKT/MRP1 通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞中的MDR，而USP22 的特異性抑制劑LY294002 可以通過對AKT通路的抑制導(dǎo)致MRP1的下調(diào)，從而抑制癌癥進(jìn)展［12］。蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶抑制劑金諾芬（auranofin）可以聯(lián)合乙醛脫氫酶抑制劑雙硫侖（disulfiram）協(xié)同誘導(dǎo)肝癌癌細(xì)胞的凋亡［38］，可作為潛在的新型抗癌策略。另外，PR619作為一種非特異性的去泛素化酶抑制劑，可以作用于多種去泛素化酶。這些都為尋找肝癌新的藥物治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

4 總結(jié)與展望

晚期肝癌的化療，如FOLFOX方案取得了一定療效，可以延長患者生存至6.5個月。靶向藥物索拉非尼、瑞格非尼、侖伐替尼等相繼獲批用于肝癌治療，但總體有效率較低。雖然免疫檢查點(diǎn)PD-1 抑制劑等逐步用于肝癌的治療中，但總體效果不令人滿意。因此，積極探索肝癌發(fā)生的分子機(jī)制對于研發(fā)新的肝癌靶向藥物具有重要的臨床意義。泛素化以及去泛素化作為調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平和活性的重要步驟，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于去泛素化酶在肝癌中作用的研究較少，僅有14個USP 家族（包括USP 亞家族的CYLD）的去泛素化分子被報道。其中有關(guān)USP22 的研究相對較多，且USP22的特異性抑制劑LY294002已被證明可以抑制癌癥進(jìn)展，但尚未開展相關(guān)臨床試驗，對去泛素化酶及其抑制劑作用有待全面深入的了解，為肝癌的靶向治療提供參考依據(jù)。