王琰，王艷

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001

周圍神經(jīng)損傷后的骨質(zhì)疏松與骨丟失增多和骨質(zhì)重塑有關(guān)，缺乏由骨細(xì)胞機(jī)械感受功能介導(dǎo)的機(jī)械載荷似乎是與骨丟失有關(guān)的病因。長期臥床休息或失重環(huán)境導(dǎo)致的機(jī)械負(fù)荷減少會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)流失[1]；而過度使用骨質(zhì)會(huì)損害組織，進(jìn)而激活骨質(zhì)重塑，實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)，因此缺失機(jī)械負(fù)荷會(huì)對骨骼重塑產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[2]。骨和骨膜被感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)纖維支配[3]，提示周圍神經(jīng)系統(tǒng)也可能參與骨代謝[4-5]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)影響感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)元的生長和分化，而感覺神經(jīng)與交感神經(jīng)分別通過神經(jīng)肽物質(zhì)P(substance P,SP)和神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)影響骨代謝[6-7]，并在調(diào)節(jié)骨骼重塑中起著重要作用[8]。無論是機(jī)械載荷、NGF、感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)對骨的合成代謝作用都與Wnt信號通路密切相關(guān)[9]。了解Wnt 信號通路與機(jī)械載荷和周圍神經(jīng)之間的作用機(jī)制，對周圍神經(jīng)損傷后骨質(zhì)疏松的防治具有十分重要的意義。

1 Wnt信號

1.1 Wnt信號發(fā)展歷程

Wnt 信號傳導(dǎo)領(lǐng)域的發(fā)展歷程十分艱難[10-11]，來自不同學(xué)科的研究人員為解決Wnt 信號傳導(dǎo)的分子奧秘做出了重要貢獻(xiàn)。Nusse 等[11]在對小鼠乳腺腫瘤病毒(mouse mammary tumor virus,MMTV)可能導(dǎo)致乳腺癌的機(jī)制研究時(shí)，用探針篩選其他腫瘤是否在同一個(gè)結(jié)構(gòu)中整合，發(fā)現(xiàn)其中的探針9 特別有用，它在許多個(gè)腫瘤中獲得整合，并且大致映射到整合集群的中間，他們稱之為int1(表示第一個(gè)常見的整合部位)。

然而確定int1 基因及其編碼蛋白的作用機(jī)制并不容易[10]，直到Rijsewijk 等[12]發(fā)現(xiàn)果蠅中的Wingless 基因是int1 的同源物，才從發(fā)育遺傳學(xué)角度揭示int1的功能。1990年左右，int命名法已經(jīng)變得不充分且令人困惑，如從腫瘤中MMTV 原病毒插入位點(diǎn)的其他篩選產(chǎn)生了其他活化基因，稱為int2、int3 和int4[13-15]。但通過序列比較，這些基因與int1 無關(guān)。為避免混淆，Nusse等[16]同意使用一個(gè)新的混合名稱‘Wnt’來表示屬于int1/Wingless系列的基因。

1.2 Wnt信號與疾病

隨著對Wnt 蛋白質(zhì)的多種生理作用所獲得的洞察力越多，就越能開始識別和掌握異常信號及其參與許多人類疾病的發(fā)病機(jī)制，從癌癥到代謝紊亂和發(fā)育缺陷[17-18]。了解Wnt 信號在骨骼疾病中的作用，不僅有助于闡明這些疾病的發(fā)病機(jī)制，更有助于探索出更具有針對性且有根據(jù)性的新治療途徑。

1.3 Wnt信號傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑

Wnt信號的傳導(dǎo)途徑可分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典途徑通過β連環(huán)蛋白(β-catenin)介導(dǎo)信號傳導(dǎo)，而非經(jīng)典途徑獨(dú)立于β-catenin 起作用[19]，其中經(jīng)典途徑在骨骼疾病中得到更好的表征。

經(jīng)典的Wnt 信號傳導(dǎo)的標(biāo)志是活化后細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin的穩(wěn)定性。當(dāng)存在經(jīng)典的Wnt 配體(Wnt1、Wnt3a 和Wnt8)時(shí)，配體與Frizzled(Fz)家族和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)5 或LRP6 結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)的散亂蛋白(dishevelled,Dvl)磷酸化，磷酸化的Dvl抑制糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)，使GSK3β活性下降，抑制其磷酸化細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin，結(jié)果使β-catenin 更穩(wěn)定并易位到細(xì)胞核中，與T 細(xì)胞因子(T cell factor,Tcf)/淋巴增強(qiáng)劑結(jié)合因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)[20-21]。若沒有Wnt 配體，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin 被蛋白質(zhì)降解復(fù)合物，如GSK3β、軸蛋白(Axin)與結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyosis coli,APC)等磷酸化，使β-catenin降解[20]。

2 Wnt信號通路與骨

2.1 Wnt信號通路與骨合成代謝

近年來Wnt 信號通路在骨生物學(xué)中的作用受到更多的關(guān)注。如骨質(zhì)疏松假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征、硬化癥和范布赫姆病等病的骨病理學(xué)都與異常的Wnt信號傳導(dǎo)有關(guān)，這些都引發(fā)骨生物學(xué)中Wnt 信號通路的進(jìn)一步研究[22-23]。骨質(zhì)疏松假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤綜合征與LRP5 基因的新突變有關(guān)，患者表現(xiàn)為因骨小梁顯著減少而導(dǎo)致多處骨折。通過LRP5 介導(dǎo)的Wnt 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)會(huì)影響生長過程中的骨累積，對峰值骨量的建立很重要[24]。硬化癥和范布赫姆病臨床表現(xiàn)為高骨量，是由于編碼硬化蛋白(sclerostin,SOST)的基因突變導(dǎo)致，SOST 是一種Wnt/βcatenin 信號傳導(dǎo)拮抗劑[25]。因此Wnt信號途徑的突變會(huì)導(dǎo)致人的骨密度發(fā)生嚴(yán)重變化。

骨量取決于骨骼重塑的過程，涉及成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的活動(dòng)，這三種細(xì)胞類型通過控制骨骼重塑，維持骨量平衡[26-27]。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)[28]，破骨細(xì)胞來源于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)[29]。一般而言，成骨細(xì)胞形成骨骼，破骨細(xì)胞吸收骨骼，骨細(xì)胞維持骨骼的穩(wěn)態(tài)，并在骨骼重塑中調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，以適應(yīng)生物力學(xué)的需要。

Glass 等[30]研究表明，β-catenin(可能是Wnt 信號)可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化并抑制破骨細(xì)胞分化。Wnt 信號通路抑制MSCs 向軟骨和成脂譜系的分化，增強(qiáng)了對成骨細(xì)胞譜系的分化[31-32]。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的Wnt/β-catenin 信號通過骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin,OPG)的分泌而間接抑制破骨細(xì)胞的分化和骨吸收[30]。Wnt 信號通路直接或間接地對成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，因此在控制骨量方面具有重要作用。

2.2 Wnt信號通過機(jī)械負(fù)荷影響骨

骨骼是一種不斷重塑的動(dòng)態(tài)器官[33]，其結(jié)構(gòu)因其機(jī)械環(huán)境而不斷變化[34]，包括軸向負(fù)荷和全身震動(dòng)在內(nèi)的許多負(fù)荷方式都會(huì)影響骨骼的重塑過程[35-36]。骨細(xì)胞通過細(xì)胞過程相互連接，在骨表面與成骨細(xì)胞相連接，形成小管網(wǎng)絡(luò)，成為響應(yīng)機(jī)械負(fù)荷的骨重塑關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[37]。骨細(xì)胞感知機(jī)械負(fù)荷并將其轉(zhuǎn)換為生化信號。機(jī)械負(fù)荷激活了Wnt信號通路，通過Wnt信號抑制劑SOST、Dickkopf-1(DKK1)等的分泌，調(diào)節(jié)位于骨表面的成骨細(xì)胞分化[38-39]。

2.2.1SOST

SOST是SOST基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，它是一種有效的骨形成抑制劑，主要由骨細(xì)胞合成[40]。該信號是骨骼機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)，通過調(diào)節(jié)其輸出以調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[39]，為骨細(xì)胞控制機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了潛在的機(jī)制。

Sawakami 等[41]發(fā)現(xiàn)，攜帶LRP5 功能突變的小鼠重現(xiàn)了在LRP5 失活突變的人類中觀察到的低骨量表型；它們幾乎無法對機(jī)械刺激進(jìn)行合成代謝反應(yīng)。提示W(wǎng)nt/LRP5 信號傳導(dǎo)是正常骨組織中機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)的組成部分，機(jī)械負(fù)荷需要LRP5 的參與才能對骨量產(chǎn)生影響。SOST 與LRP5/6 Wnt 共受體結(jié)合，從而抑制Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)[42]，SOST 一直被認(rèn)為是骨骼中的“機(jī)械傳感器”[43]。因此，SOST 成為了機(jī)械負(fù)荷誘導(dǎo)Wnt/LRP5信號的候選人。

Robling 等[44]發(fā)現(xiàn)，尺骨負(fù)荷顯著降低SOST轉(zhuǎn)錄和SOST水平，后肢卸載顯著增加SOST 表達(dá)。提示W(wǎng)nt 信號抑制劑SOST 受機(jī)械負(fù)荷的調(diào)節(jié)。此外長期的SOST 缺失會(huì)抑制由機(jī)械負(fù)荷的減少而引起的骨質(zhì)疏松[45]。再次證明在骨骼機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中Wnt 信號是關(guān)鍵的一步。但是機(jī)械負(fù)荷影響SOST 表達(dá)的作用機(jī)制目前尚不明確，一種假設(shè)是由于SOST 在局部成骨細(xì)胞不受控制地形成骨的時(shí)候，為了調(diào)節(jié)骨量在可控范圍內(nèi)，會(huì)由骨細(xì)胞大量的生成和分泌[44]。骨細(xì)胞感受到局部應(yīng)力，SOST 水平降低，增強(qiáng)Wnt 信號的表達(dá)，使局部的成骨細(xì)胞形成骨，最終導(dǎo)致高應(yīng)變區(qū)新骨生成。Robling 等[44]也發(fā)現(xiàn)，DKK1表達(dá)下調(diào)，DKK1對LRP5/6同樣具有高親和力，也主要由骨細(xì)胞合成[38]。因此DKK1 也可以解釋機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中Wnt信號的增強(qiáng)。

2.2.2DKK1

DKK1 是Wnt 信號通路細(xì)胞外另一種拮抗劑，它主要由骨細(xì)胞合成[44]。DKK1 與Kremen 和LRP5/6 在質(zhì)膜上形成三元復(fù)合物，從而防止LRP5/6與Wnt配體結(jié)合[46]。

DKK1 在成骨細(xì)胞內(nèi)的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)減少[47]，而DKK1的雜合子或純合子缺失導(dǎo)致骨量依賴性增加，這可能是由于骨形成增加并且骨吸收沒有改變[48-49]。在骨骼機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中，像SOST 一樣，DKK1 也有作用。特別是在嚙齒動(dòng)物模型中，當(dāng)機(jī)械負(fù)荷增加后，SOST和DKK1的表達(dá)均被抑制[50-51]。

Morse 等[52]發(fā)現(xiàn)，DKK1基因敲除小鼠對脛骨負(fù)荷的反應(yīng)增加了脛骨的骨量。因此，DKK1 基因敲除動(dòng)物對機(jī)械負(fù)荷敏感性增強(qiáng)。有報(bào)道假設(shè)SOST 和DKK1 在缺乏的情況下可以在骨髓腔內(nèi)互相補(bǔ)償[45]。Van Lierop 等[53]發(fā)現(xiàn)，SOST 缺乏癥患者的血清DKK1 水平升高。但是在DKK1基因敲除小鼠和野生型小鼠中，SOST表達(dá)隨載荷增加而下降[52]。這可能是因?yàn)镾OST本身對負(fù)荷更敏感，并在負(fù)荷增加的條件下被下調(diào)[44,50]。盡管DKK1 與SOST 都屬于Wnt 拮抗劑，并具有相似的功能，但DKK1在調(diào)節(jié)骨量方面的作用可能不如SOST重要。

2.3 Wnt信號通過周圍神經(jīng)作用于骨

2.3.1NGF

NGF是一系列神經(jīng)營養(yǎng)因子中的第一個(gè)，它影響交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)元的生長和分化。成年骨骼中的絕大多數(shù)(80%)無髓鞘/薄髓鞘的感覺神經(jīng)纖維神經(jīng)表達(dá)NGF 高親和力受體，即神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptors A,TrkA)[54-55]。

Tomlinson 等[56]指出，NGF 信號通過TrkA 指導(dǎo)發(fā)育中小鼠股骨的神經(jīng)支配，以促進(jìn)血管形成和骨祖細(xì)胞的進(jìn)程，建立了NGF-TrkA 信號與骨代謝的聯(lián)系。他們研究的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是骨細(xì)胞中受機(jī)械載荷誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin 信號受NGF-TrkA信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)。在骨膜和尺骨內(nèi)膜上的成骨細(xì)胞中，NGF急劇上調(diào)，表明此區(qū)域的感覺神經(jīng)通過NGF-TrkA 信號對機(jī)械刺激作出了反應(yīng)。但是骨細(xì)胞中不表達(dá)NGF，而是表達(dá)強(qiáng)大的βcatenin報(bào)告基因活性，而成骨細(xì)胞中β-catenin缺失不會(huì)影響負(fù)荷誘導(dǎo)的NGF 表達(dá)。這表明成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞可能通過獨(dú)特的盡管可能重疊的機(jī)制對體內(nèi)骨骼負(fù)荷作出反應(yīng)。Wnt配體在神經(jīng)軸突中被隔離，所以在感覺神經(jīng)中的NGF-TrkA 不可能直接刺激骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號表達(dá)，而是通過激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶進(jìn)而抑制GSK3β 來促進(jìn)β-catenin 在軸突尖端定位[57]。此外，NGF-TrkA 信號是使NGF 信號從軸突末端傳遞到交感神經(jīng)元胞體的信使[58]，并對感覺神經(jīng)分泌的SP 的釋放也具有促進(jìn)作用[59]。

2.3.2SP

SP 是骨骼感覺神經(jīng)元分泌的11 個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽[60]，也是廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的一種神經(jīng)遞質(zhì)，對骨組織形成具有重要的調(diào)節(jié)作用[61]。Wang等[62]發(fā)現(xiàn)，跑步機(jī)與電針相結(jié)合可以預(yù)防坐骨神經(jīng)損傷后脛骨骨丟失的潛在機(jī)制，可能與SP 的表達(dá)增加相關(guān)。Fu 等[63-64]發(fā)現(xiàn)，SP 可以調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨細(xì)胞分化、增殖和凋亡，促進(jìn)骨折愈合。

關(guān)于SP 刺激BMSCs 增殖的機(jī)制目前研究較少。一種可能的機(jī)制是SP 可以通過激活Wnt 途徑的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，以及通過移位β-catenin 來增強(qiáng)BMSCs 的分化，并且增強(qiáng)BMSCs的遷移能力，對血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)也有促進(jìn)作用[64]。因此，SP 可能通過Wnt 途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)BMSCs的血管生成能力。但是SP 是否通過Wnt 信號介導(dǎo)血管生成還需要進(jìn)一步探討。

2.3.3NPY

NPY 是高度保守的36 個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽，在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[65-66]，目前已知在促進(jìn)多種細(xì)胞和組織的增殖、血管生成和遷移中具有重要的信號傳導(dǎo)功能。然而，關(guān)于NPY對BMSCs增殖和凋亡的特定作用卻少為人知[6]。

Liu 等[67]指出，NPY 刺激BMSCs 的成骨細(xì)胞分化和遷移。Wu 等[68]發(fā)現(xiàn)，NPY 以濃度依賴的方式顯著促進(jìn)BMSCs 的增殖，在增殖和凋亡過程中，NPY還增加了經(jīng)典的Wnt信號通路蛋白(包括β-catenin)的mRNA 和蛋白表達(dá)水平，激活Wnt 信號通路傳導(dǎo)，從而刺激BMSCs的成骨細(xì)胞分化。Dong等[69]發(fā)現(xiàn)，褪黑激素治療上調(diào)NPY 和NPY 受體Y1(NPY1R)的表達(dá)，并促進(jìn)MSC的增殖和遷移。提示褪黑激素通過NPY/NPY1R信號傳導(dǎo)促進(jìn)MSCs的成骨細(xì)胞分化和骨折愈合。

NPY是否促進(jìn)BMSCs的增殖，研究之間還存在分歧。Lee等[70]發(fā)現(xiàn)，NPY 系統(tǒng)通過Y1 受體直接抑制間充質(zhì)祖細(xì)胞的分化以及成熟成骨細(xì)胞的活性，構(gòu)成Y1 受體缺失小鼠中明顯存在的高骨量表型的可能機(jī)制。

因此NPY 在BMSCs 增殖和凋亡中的具體作用，可能對于維持體內(nèi)適當(dāng)數(shù)量的BMSCs 至關(guān)重要，并且通過β-catenin 信號的傳導(dǎo)，對成骨細(xì)胞也起著重要的作用[68]。但是目前尚未得到充分的論證，需要進(jìn)一步闡明。

3 小結(jié)

目前已有的研究證實(shí)Wnt信號通路可以通過機(jī)械負(fù)荷和周圍神經(jīng)兩方面調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)損傷后骨的合成與代謝。機(jī)械負(fù)荷主要是由Wnt 信號抑制劑SOST、DKK1 等調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，進(jìn)而影響骨骼重塑的過程。周圍神經(jīng)主要是通過感覺神經(jīng)分泌的SP 和交感神經(jīng)分泌的NPY，以及影響感覺神經(jīng)和交感神經(jīng)元生長和分化的NGF，對骨組織的形成具有重要作用，三者都與Wnt信號通路密切相關(guān)。因此可以從“力學(xué)”和“神經(jīng)學(xué)”兩方面入手進(jìn)行干預(yù)和防治。

盡管已經(jīng)明確了經(jīng)典Wnt途徑對骨骼合成代謝的關(guān)鍵性作用，但是非經(jīng)典Wnt途徑還需進(jìn)一步闡明，影響Wnt信號途徑的其他因子以及與其他信號的串?dāng)_方面仍有待發(fā)現(xiàn)。