陳翔，曾朝瑋，申瑾，郭家俊，章中*

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，寧夏 銀川，750002)

細(xì)菌芽孢因其特有的結(jié)構(gòu)，對(duì)物理、化學(xué)等脅迫條件具有極強(qiáng)抗性，常見(jiàn)單一殺菌方法和條件都很難將其殺滅[1-4]。熱處理是一項(xiàng)傳統(tǒng)殺菌技術(shù)，因其高效、清潔、成本低廉的特點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用。

但是過(guò)高的殺菌溫度往往會(huì)改變食品質(zhì)構(gòu)，甚至劣化食品的風(fēng)味或品質(zhì)[5-8]。使用中溫?zé)釟⒕軌虮苊庖陨锨闆r發(fā)生，但殺菌效果較差。乙醇亦是常見(jiàn)的殺菌劑，存在于許多食品中，它能夠使細(xì)菌細(xì)胞膜脫水、鈍化與生理活動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響細(xì)胞活性使之死亡[9-11]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，編號(hào)As 1.433，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；枯草芽孢桿菌芽孢皮層裂解酶(純度>95%)，南京鐘鼎生物技術(shù)公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物公司；促芽孢生長(zhǎng)錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，向營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入MnSO4·H2O(Mn2+質(zhì)量濃度為50 mg/L)，調(diào)節(jié)pH值至中性后滅菌備用；平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar, PCA)，青島海博生物技術(shù)公司；Tris-HCl緩沖液，北京索萊寶科技公司；2-巰基乙醇(分析純)，上海海曲化工公司；無(wú)水乙醇(分析純)，天津元力化學(xué)試劑公司；十二烷基硫酸鈉(分析純)，上海阿拉丁公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、四硼酸鈉(均為分析純)，天津大茂化學(xué)試劑廠；溴化鉀，上海廣諾化學(xué)科技公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DSX-280B型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；Scientz-1LS真空冷凍干燥儀，寧波新芝生物科技公司；TG16-W醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)公司；HWS-12型電子恒溫水浴鍋，上海合恒儀器設(shè)備公司；FE28型PH計(jì)，梅特勒-托利多(上海)公司；970 CRT熒光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器公司；Spectrum Two型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 芽孢懸浮液的制備

芽孢的制備參照GAO[15]的方法，將已活化的枯草芽孢桿菌接入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，在滅菌后的促芽孢生長(zhǎng)錳鹽營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面上劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，使用無(wú)菌蒸餾水洗滌并收集菌體，離心后再洗滌3次(4 ℃、8 000 r/min、15 min)，離心濃縮(8 000 r/min、15 min)重懸于無(wú)菌蒸餾水中的芽孢，測(cè)定菌液吸光度并調(diào)節(jié)芽孢濃度約為1.5×109CFU/mL，4℃保存，使用時(shí)稀釋芽孢濃度至108CFU/mL，一個(gè)月內(nèi)使用。

1.3.2 中溫結(jié)合乙醇處理枯草芽孢桿菌及芽孢皮層裂解酶

吸取1 mL按1.3.1步驟處理的芽孢懸浮液至50 mL聚四氟乙烯離心管，分別加入9 mL體積分?jǐn)?shù)為30%、75%的乙醇溶液，設(shè)置溫度梯度為4、37、50和80 ℃；對(duì)照組加入9 mL Tris-HCl(pH=8.0，0.1 mol/L)緩沖液，設(shè)置溫度為常溫及80 ℃；恒溫水浴處理20 min后立即取出置于冰水浴中冷卻至常溫。

所以，在瑞士買(mǎi)荷蘭豬，必須成雙成對(duì)地購(gòu)買(mǎi)。而且，一對(duì)荷蘭豬中，如果有一只不幸先離世，主人還要為活著的那只重新配對(duì)。于是，在瑞士就出現(xiàn)了荷蘭豬租賃業(yè)務(wù)，主人可以為失去伙伴的荷蘭豬租賃一位新朋友。這項(xiàng)法律的保護(hù)對(duì)象還涵蓋其他需要社群生活的動(dòng)物，比如貓和金魚(yú)等。此外，這項(xiàng)法律還規(guī)定，想養(yǎng)狗的人必須先接受一系列課程培訓(xùn)，合格后方能擁有自己的動(dòng)物伙伴。這真是小動(dòng)物們的福音呀！

稱取1.5 mg芽孢皮層裂解酶凍干粉，加入1mL Tris-HCl緩沖液，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、75%的乙醇溶液4 mL，使得酶液終濃度為0.3 mg/mL，設(shè)置溫度梯度為4、37、50和80 ℃。對(duì)照組則加入5 mL Tris-HCl緩沖液，設(shè)置溫度為常溫及80 ℃；恒溫水浴處理20 min后立即取出置于冰水浴中冷卻至常溫。

1.3.3 中溫結(jié)合乙醇處理殺滅枯草桿菌芽孢效果

取1.3.2處理后的枯草芽孢桿菌懸浮液，以緩沖液常溫處理組為對(duì)照，參考食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[16]，進(jìn)行傾注計(jì)數(shù)并計(jì)算菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值及殺滅率。

1.3.4 芽孢皮層裂解酶的活性測(cè)定

1.3.4.1 脫芽孢衣芽孢的制備

脫芽孢衣芽孢的制備在文獻(xiàn)[17]基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。用pH值為10.0，濃度為0.1 mol/L的硼酸鹽緩沖液(含有30 mmol/L十二烷基硫酸鈉、0.2 mol/L 2-巰基乙醇)在40 ℃處理枯草芽孢桿菌芽孢，8 h后用無(wú)菌蒸餾水離心(8 000 r/min，4 ℃，15 min)洗滌至凈。

1.3.4.2 皮層裂解酶活性測(cè)定

酶活性分析參照MAKINO[18]和MIYATA[19]方法，將脫孢衣芽孢懸浮液預(yù)先于32 ℃恒溫水浴20 min。取脫孢衣芽孢懸浮液2 mL與2 mL經(jīng)不同處理的酶液混合，32 ℃反應(yīng)80 min后測(cè)定OD600值，計(jì)算酶活。對(duì)照組為2 mL無(wú)菌水和2 mL脫芽孢衣芽孢懸浮液。酶活性通過(guò)脫芽孢衣芽孢懸浮液的OD600值的減少量來(lái)測(cè)定，即以每分鐘OD600值變化0.001所需的酶量為一個(gè)活性單位(U)。計(jì)算公式為：

(1)

式中：X，酶活，U/L；V，參與反應(yīng)的酶量，mL；t，反應(yīng)時(shí)間，min。

1.3.5 皮層裂解酶的熒光光譜測(cè)定

取1.3.2處理后的皮層裂解酶2.5 mL在280 nm激發(fā)波長(zhǎng)(λex)，波長(zhǎng)范圍295～450 nm，掃描速度240 nm/min，發(fā)射和激發(fā)光路的狹縫寬度均為10 nm條件下測(cè)定皮層裂解酶溶液的熒光光譜。

1.3.6 皮層裂解酶的傅立葉紅外變換光譜(fourier transform infrared spectroscopy， FTIR)掃描

采用傅立葉變換紅外光譜儀對(duì)皮層裂解酶進(jìn)行光譜采集。稱取2 mg的1.3.2處理后的皮層裂解酶溶液，凍干，于瑪瑙研缽中磨粉，再與干燥的溴化鉀粉末(100 mg，粒度200目)混合均勻，壓片后待測(cè)。設(shè)置掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，波數(shù)精度為0.01 cm-1，平衡時(shí)間為300 s，掃描次數(shù)為32次。使用Peakfit version 4.12軟件在酰胺I帶校正基線，Gaussian法去卷積，做二階導(dǎo)數(shù)擬合，多次擬合使殘差最小[20]。計(jì)算枯草桿菌皮層裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Office 2010計(jì)算數(shù)據(jù)，Origin 2018作圖，SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 中溫結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草芽孢桿菌的殺滅效果

中溫結(jié)合乙醇處理后枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)變化見(jiàn)圖1，緩沖液常溫及80 ℃處理20 min后，活菌數(shù)分別為2.9×108、2.8×108CFU/ml?？梢?jiàn)，單一的80 ℃熱處理滅菌方式并不能有效殺滅枯草芽孢桿菌。郭全有等[21]研究了蝦源地衣芽孢桿菌在不同溫度水浴殺菌前后孢子數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)80、85 ℃水浴條件下，孢子存活率僅下降了1.26%、1.18%。李素等[22]研究發(fā)現(xiàn)，采用90 ℃及95 ℃對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌芽孢熱脅迫致死效果較差，加熱40 min后致死率僅為47.55%、54.18%。芽孢桿菌較高的耐熱性在上述文獻(xiàn)和本文實(shí)驗(yàn)中都得到再次印證。隨著溫度升高，菌落數(shù)總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，除50 ℃時(shí)體積分?jǐn)?shù)為30%、75%乙醇處理組無(wú)顯著差異外(P<0.05)，4、37、80 ℃溫度條件下75%乙醇(體積分?jǐn)?shù))處理的滅菌效果優(yōu)于30%(體積分?jǐn)?shù))處理組。殺滅率依次為19.2%、9.2%、45.6%、92.7%、28.7%、23.5%、43.9%和94.8%。與37 ℃相比，4 ℃時(shí)芽孢處于休眠狀態(tài)，增殖率低下，從而表現(xiàn)出殺滅率較高的狀態(tài)。80 ℃時(shí)，體積分?jǐn)?shù)為30%、75%乙醇處理組的活菌數(shù)最低，說(shuō)明此時(shí)殺菌效果最強(qiáng)。

圖1 中溫結(jié)合乙醇?xì)缈莶菅挎邨U菌效果Fig.1 Effect of medium temperature and ethanol treatment to kill Bacillus subtilis

2.2 中溫結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草芽孢桿菌皮層裂解酶活性的影響

溫度結(jié)合體積分?jǐn)?shù)為30%、75%乙醇處理后枯草芽孢桿菌皮層裂解酶的活性變化如圖2所示。

圖2 中溫結(jié)合乙醇對(duì)皮層裂解酶的活性的影響Fig.2 Effect of medium temperature and ethanol treatment on cortex-lytic enzyme activity

可以看出，溫度為4 ℃時(shí)，30%、 75%的乙醇溶液中皮層裂解酶活性分別為(90.8±2.07)、(53.2±4.04) U/L；37 ℃處理時(shí)，體積分?jǐn)?shù)為30%、75%的乙醇溶液中皮層裂解酶活性均為最佳，活性分別為(97.8±1.54)、(69.8±3.56) U/L；當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，皮層裂解酶活性迅速下降，分別降至(76.0±3.20)、(60.8±4.07) U/L；溫度80 ℃時(shí)，皮層裂解酶基本失活，活度僅為(24.3±2.73)、(20.4±2.17) U/L。隨著處理溫度的升高，酶活性呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，與圖1中滅菌效果基本一致。以緩沖液常溫處理為對(duì)照組，僅緩沖液80 ℃處理后，枯草芽孢桿菌皮層裂解酶的活性下降為(62.5±1.39) U/L，酶活性顯著下降(P<0.05)，但此時(shí)酶活性仍明顯高于80 ℃結(jié)合不同體積分?jǐn)?shù)乙醇處理組，結(jié)果表明，中溫結(jié)合乙醇處理能夠更為有效地抑制皮層裂解酶活性。

陳娟等[23]研究發(fā)現(xiàn)隨著熱處理溫度升高或時(shí)間的延長(zhǎng),椰子水中氧化物酶和多酚氧化酶的相對(duì)酶活力均隨之降低，90 ℃和95 ℃熱處理4 min后，活力分別降低90%以上。吳秋昊[24]通過(guò)微波加熱處理核桃仁后,其脂氧合酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的活性均比未處理樣品的酶活性顯著降低(P<0.05)，微波功率越大,酶活性降低越快。酶類物質(zhì)大多對(duì)溫度較敏感，高溫和低溫都能降低其活性，但加入乙醇處理時(shí)酶活性的變化則不盡相同。如用乙醇處理西藍(lán)花后酸性轉(zhuǎn)化酶、蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶活性有增加也有下降[25]。同樣，乙醇處理后的藍(lán)莓中苯丙氨酸解氨酶呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[26]。

2.3 中溫結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草芽孢桿菌皮層裂解酶熒光光譜的影響

熒光光譜的變化與酶分子色氨酸和酪氨酸等生色基團(tuán)的微環(huán)境等多方面因素相關(guān)。分子中從Tyr殘基到Trp殘基之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致Tyr殘基的熒光熄滅和Trp殘基的熒光增加，其峰位在325～350 nm之間[27]。中溫結(jié)合乙醇的皮層裂解酶熒光光譜見(jiàn)圖3。

a-緩沖液、常溫;b-30%乙醇、4 ℃;c-30%乙醇、37 ℃;d-30%乙醇、50 ℃;e-緩沖液、80 ℃;f-75%乙醇、4 ℃；g-30%乙醇、80 ℃；h-75%乙醇、37 ℃;i-75%乙醇、50 ℃;j-75%乙醇、80 ℃(乙醇濃度均為體積分?jǐn)?shù)，下同)圖3 中溫結(jié)合乙醇處理的皮層裂解酶熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of cortex-lytic enzyme after medium temperature and ethanol treatment

如圖3所示，色氨酸最大吸收峰位置紅移了3 nm。與緩沖液常溫處理相比，緩沖液80 ℃處理時(shí)皮層裂解酶熒光強(qiáng)度出現(xiàn)下降，表明中溫處理在一定程度上改變了其結(jié)構(gòu)。但改變幅度并不如加入乙醇處理后的熒光強(qiáng)度降低劇烈，說(shuō)明乙醇的加入是改變皮層裂解酶結(jié)構(gòu)的重要因素。中溫結(jié)合30%乙醇(體積分?jǐn)?shù))處理組的皮層裂解酶熒光強(qiáng)度高于中溫結(jié)合75%乙醇(體積分?jǐn)?shù))處理組，且不同溫度處理后的皮層裂解酶熒光強(qiáng)度順序?yàn)椋?0 ℃<50 ℃<37 ℃<4 ℃，表明隨著處理溫度的增加皮層裂解酶結(jié)構(gòu)變化程度逐漸加劇。研究認(rèn)為，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，酸性酶發(fā)生微弱的紅移，分子中酪氨酸和色氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生變化，酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[28]。中溫結(jié)合乙醇處理后的熒光光譜變化亦表明皮層裂解酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，且75%乙醇(體積分?jǐn)?shù))對(duì)皮層裂解酶結(jié)構(gòu)的影響更大。

2.4 中溫結(jié)合乙醇處理對(duì)皮層裂解酶紅外光譜的影響

中溫結(jié)合乙醇處理后的皮層裂解酶紅外光譜如圖4。與對(duì)照組相比，處理后的皮層裂解酶紅外光譜酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)出現(xiàn)2個(gè)吸收峰；1 666 cm-1附近的吸收峰未發(fā)生變化。1 626 cm-1處吸收峰紅移至1 630 cm-1。酰胺Ⅱ帶(1 600～1 500 cm-1)處無(wú)峰；酰胺Ⅲ帶(1 301～1 229 cm-1)吸收峰從1 293 cm-1紅移至1 296 cm-1。溫度結(jié)合乙醇濃度處理破壞了分子內(nèi)氫鍵，使峰位向高波數(shù)移動(dòng)。

圖4 中溫結(jié)合乙醇處理對(duì)皮層裂解酶傅立葉紅外光譜的影響Fig.4 Effects of medium temperature and ethanol treatment on the FTIR of cortex-lytic enzyme

對(duì)處理后的皮層裂解酶紅外光譜酰胺I帶進(jìn)行擬合，得到擬合曲線見(jiàn)圖5。枯草芽孢桿菌皮層裂解酶蛋白酰胺Ⅰ帶是多氨基酸殘基經(jīng)重疊形成的寬峰。利用二階導(dǎo)數(shù)及Gaussian法去卷積擬合得到10個(gè)子吸收峰。對(duì)各子峰進(jìn)行確認(rèn)，計(jì)算峰面積及含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

a-緩沖液、常溫;b-30%乙醇、4 ℃;c-30%乙醇、37 ℃;d-30%乙醇、50 ℃;e-緩沖液、80 ℃;f-30%乙醇、80 ℃;g-75%乙醇、4 ℃;h-75%乙醇、37 ℃;i-75%乙醇、50 ℃;j-75%乙醇、80 ℃圖5 中溫結(jié)合乙醇處理皮層裂解酶酰胺I帶曲線擬合譜圖Fig.5 Curve fitting spectra of cortex-lytic enzyme amide I treated with medium temperature and ethanol

由表1可知，與緩沖液常溫處理相比，緩沖液80 ℃處理后，皮層裂解酶α-螺旋顯著減少，其余二級(jí)結(jié)構(gòu)也有不同程度的增加，但對(duì)皮層裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)改變效果明顯不如相同溫度結(jié)合乙醇的處理組顯著，說(shuō)明中溫能夠改變皮層裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)。有機(jī)溶劑處理會(huì)導(dǎo)致脂肪酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的變化，且極性越強(qiáng)效果越明顯[29]。中溫結(jié)合不同濃度乙醇處理后皮層裂解酶的α-螺旋含量均減少，且隨著處理溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，減少的趨勢(shì)更明顯，說(shuō)明熱和乙醇處理后，皮層裂解酶中氫鍵發(fā)生斷裂導(dǎo)致解螺旋發(fā)生[30]。β-折疊結(jié)構(gòu)含量總體呈下降趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角含量并無(wú)明顯的升降規(guī)律。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明中溫結(jié)合乙醇處理后皮層裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終導(dǎo)致酶活力的改變。

表1 中溫結(jié)合乙醇處理對(duì)皮層裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 單位：%Table 1 Effects of medium temperature and ethanol treatment on secondary structures of cortex-lytic enzyme

注：同列小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0. 05)。

3 結(jié)論

中溫(80 ℃)結(jié)合乙醇能夠殺滅芽孢，顯著減少活菌數(shù)，芽孢皮層裂解酶在體積分?jǐn)?shù)為30%和75%的乙醇溶液結(jié)合中溫80 ℃處理時(shí)，皮層裂解酶基本失活。熒光光譜顯示，體積分?jǐn)?shù)為30%、75%乙醇協(xié)同溫度處理得皮層裂解酶發(fā)生明顯紅移，三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，乙醇協(xié)同熱處理能使皮層裂解酶鈍化，且高濃度乙醇和較高溫度處理更易改變皮層裂解酶三級(jí)結(jié)構(gòu)。紅外光譜顯示，皮層裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲含量均發(fā)生變化。綜上，中溫結(jié)合乙醇處理后皮層裂解酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致酶活力的改變。