劉玉春，郭超，郭偉群

(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京，100037)

玉米皮是玉米深加工的主要副產(chǎn)物之一，占玉米籽粒質(zhì)量的15%左右[1]，玉米皮中半纖維素含量可達(dá)到68%[2]，與其他植物來源的半纖維素相比，其具有支鏈化程度高的特點(diǎn)，其主鏈的每一個(gè)木聚糖殘基幾乎都連接有支鏈殘基[3]。玉米皮纖維的生物降解涉及到多種酶的協(xié)同作用，包括木聚糖的主鏈降解酶——木聚糖酶(xylanase)、木糖苷酶(xylosidase)以及多種支鏈降解酶[4]。目前，玉米皮多作為廉價(jià)的飼料出售，為提高其利用價(jià)值，已有應(yīng)用玉米皮發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉[5]、酵母菌發(fā)酵玉米皮制備菌體蛋白[6]、玉米皮發(fā)酵培養(yǎng)琥珀酸放線桿菌產(chǎn)丁二酸[7]等方面研究。

裂褶菌(Schizophyllumcommune)具有較強(qiáng)的半纖維素和纖維素的分解能力，能夠在含有半纖維素的基質(zhì)上良好地生長(zhǎng)[8]。本課題組在前期研究中，已經(jīng)測(cè)定了玉米皮纖維發(fā)酵培養(yǎng)裂褶菌的產(chǎn)酶情況，包括木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸酶[9]；同時(shí)完成了1個(gè)木聚糖酶基因的克隆和異源表達(dá)[9]。但與玉米皮木聚糖連接的阿拉伯糖支鏈抑制了木聚糖水解酶的活性，而α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55)能從含有阿拉伯糖殘基的多聚物的非還原末端水解1個(gè)阿拉伯糖分子，該酶同木聚糖酶復(fù)合后具有協(xié)同作用，能夠促進(jìn)玉米皮木聚糖降解。因此，本研究設(shè)計(jì)克隆裂褶菌α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，并完成其在畢赤酵母中的異源表達(dá)。

真菌轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析具有速度快、信息全面的優(yōu)點(diǎn)，能夠全面分析特定培養(yǎng)條件下基因轉(zhuǎn)錄的情況[10]。例如，對(duì)灰樹花的菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，獲得了該菌株生長(zhǎng)過程中參與多糖合成的基因的表達(dá)情況[11]。與真菌的全基因組測(cè)序分析相比，轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果中不含內(nèi)含子及其他非編碼的核酸序列，可以更高效地分析與培養(yǎng)條件相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄情況。

本研究是以玉米皮纖維為唯一碳源發(fā)酵培養(yǎng)裂褶菌為樣本，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析與玉米皮纖維降解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況；同時(shí)克隆了裂褶菌糖苷水解酶62家族蛋白基因Sabf32，并完成該基因在畢赤酵母中的表達(dá)，研究為木聚糖酶與α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶協(xié)同降解玉米皮纖維提供了基礎(chǔ)，同時(shí)為玉米皮的增值利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

裂褶菌S.communeDB01，本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。

1.1.2 主要試劑

D-木糖、樺木木聚糖，Megazyme公司；PDA培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；3,5二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、NaOH，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；對(duì)硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(4-nitrophenyl α-L-arabinofuranoside，pNPAF)，Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

DK-8D電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PL2002IC電子天平，Mettler公司；MQD-SIR單層小容量振蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；SynergvHT酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；ND OneCNanoDropTM微量紫外-可見光分光光度計(jì)，Thermo Fisher公司；電泳儀、凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

玉米皮纖維誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分[12](g/L)：蛋白胨1、尿素0.2、CaCl20.3、MgSO4·H2O 0.3、KH2PO42、(NH4)2SO44.2、0.2%(v/v)微量元素(CoCl21.6、MnSO4·4H2O 1.6、ZnSO4·7H2O 1.4、FeSO4·7H2O 5)，玉米皮纖維10，作為碳源。

菌株經(jīng)PDA平板活化后，將裂褶菌接種于300 mL玉米皮纖維培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)120 h。在培養(yǎng)過程中，取發(fā)酵液作為檢測(cè)樣品，取樣過程中應(yīng)盡量避免振蕩，將發(fā)酵液于12 000×g離心5 min后取上清液待測(cè)。

1.2.2 發(fā)酵液中蛋白質(zhì)、還原糖和酶活力測(cè)定

發(fā)酵液還原糖含量測(cè)定：將100 μL上清液加水稀釋至200 μL，加入300 μL DNS試劑，混合后置于沸水浴5 min，迅速冷卻后在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

木聚糖酶活性測(cè)定[13]，反應(yīng)體系為：100 μL適量稀釋的發(fā)酵液上清、100 μL底物(10 g/L，樺木木聚糖)，在40 ℃保溫10 min，然后加入300 μL試劑終止反應(yīng)，沸水煮5 min并冷卻，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：根據(jù)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定。

1.2.3 裂褶菌總RNA提取及測(cè)序

菌株經(jīng)PDA平板活化后，接種玉米皮纖維培養(yǎng)基，于30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)48 h。抽濾液體培養(yǎng)基得到菌絲體，稱取0.1～0.3 g菌絲體于研缽中，加入液氮，并在液氮保護(hù)下快速研磨，樣品研磨至無顆粒呈粉狀，將研磨好的粉末移入裝有Trizol的離心管中。用Trizol法提取裂褶菌總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。應(yīng)用微量紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度及純度(A260/A280 nm及A260/A230 nm)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析及注釋分類

Illumina HiSeq測(cè)序后對(duì)原始序列進(jìn)行過濾(測(cè)序工作由安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司完成)，用組裝軟件Trinity(20140717版)[14]組裝出全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列，將每個(gè)基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)Unigene進(jìn)行NR(non-redundant protein sequence database；non-redundant protein sequences from GenPept, Swissprot, PIR, PDF, PDB, and NCBI RefSeq)、NT(nucleotide sequence database；all traditional divisions of GenBank, EMBL, and DDBJ excluding bulk divisions)數(shù)據(jù)庫(kù)的物種分布分析[16]，同時(shí)進(jìn)行BLASTP和BLASTX分析、統(tǒng)計(jì)、排序，確定數(shù)目前10的物種種類。其他能比對(duì)上的物種總稱為Others。

Unigene的GO注釋[17]是以基因NR注釋信息為基礎(chǔ)，獲得每個(gè)Unigene的注釋信息。對(duì)Unigene進(jìn)行功能分類統(tǒng)計(jì)(WEGO)，從生物過程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)3方面對(duì)裂褶菌Unigene的功能分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并分析其分布特征。

1.2.5 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，獲得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因Sabf32的序列信息，應(yīng)用SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)預(yù)測(cè)Sabf32的信號(hào)肽序列，設(shè)計(jì)畢赤酵母表達(dá)引物：EcoRIsAfF：5′-CCG GAATTC CAGGCGTGCGACCTCCCGT-3′；NotIsAfR：5′-ATAGTTTA GCGGCCGC AGCCTGGGTAAGCAAGCCGGG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

應(yīng)用限制性內(nèi)切酶：EcoR I和NotI分別將質(zhì)粒pPIC9K和Sabf32進(jìn)行雙酶切；將酶切產(chǎn)物純化后，應(yīng)用T4 DNA連接酶構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Sabf32。應(yīng)用PCR擴(kuò)增驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步通過測(cè)序驗(yàn)證核酸序列。

1.2.6 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的畢赤酵母表達(dá)

應(yīng)用電擊轉(zhuǎn)化將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Sabf32和pPIC9K空載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得陽(yáng)性重組子。應(yīng)用BMGY對(duì)重組子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體后用BMMY培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；取誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液，7 000×g離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)(轉(zhuǎn)化、重組子篩選及發(fā)酵條件參照Invitrogen公司的畢赤酵母菌實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè))。應(yīng)用陰離子交換樹脂純化重組蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和分析重組蛋白的分子量。

1.2.7 重組酶Sabf32的酶活力測(cè)定

酶活力測(cè)定體系：25 μL 4 mmol/L pNPAF溶液，15 μL 0.1 mol/L pH 6.0 檸檬酸緩沖液混勻，加入10 μL適當(dāng)稀釋酶液。反應(yīng)條件：將反應(yīng)體系在40 ℃反應(yīng)10 min，迅速加入150 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)定OD值。將經(jīng)過10 min沸水浴滅活的酶液做空白對(duì)照。用對(duì)硝基苯酚制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶解反應(yīng)體系中產(chǎn)生的對(duì)硝基苯酚含量。酶活的定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol/L的對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.8 重組Sabf32的酶學(xué)性質(zhì)研究

酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性：在pH 6.0的條件下，用適當(dāng)稀釋的酶液分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃下測(cè)定酶活，反應(yīng)10 min，以最高酶活力為100%，計(jì)算各個(gè)溫度下的相對(duì)酶活力。溫度穩(wěn)定性是將適當(dāng)稀釋的酶液分別置于40、50、60 ℃下，保溫60 min，測(cè)定殘余酶活。

酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性：分別配制pH 2.0～8.0含pNPAF的緩沖液，在最適溫度下測(cè)定不同pH值下的相對(duì)酶活，確定該酶的最適pH反應(yīng)條件。pH值穩(wěn)定性的測(cè)定是將濃縮后的酶液在上述不同pH條件下處理30 min后，調(diào)節(jié)至最適pH下，測(cè)定其殘余酶活。

1.2.8 比活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

應(yīng)用Lowry法測(cè)定純化重組酶Sabf32的蛋白濃度；在最適反應(yīng)條件下(pH 5.0，40 ℃)測(cè)定重組酶Sabf32的活性，計(jì)算Sabf32的比酶活力。

在最適反應(yīng)條件下，測(cè)定Sabf32催化不同濃度的pNPAF(1～4 mmol/L)釋放的產(chǎn)物量，利用米氏方程(Lineweaver-Burk)繪制曲線，求出Km值和Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液中蛋白質(zhì)、還原糖和酶活力測(cè)定

將裂褶菌在以玉米皮纖維為唯一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，120 h發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果顯示其生長(zhǎng)良好，該菌株能夠?qū)⒂衩灼だw維轉(zhuǎn)化為其菌體生長(zhǎng)所必須的碳源。

通過測(cè)定發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度、還原糖含量和木聚糖酶酶活力，確定了裂褶菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的取樣條件。其中發(fā)酵液中還原糖含量在培養(yǎng)48 h后達(dá)到最高(圖1)，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，濃度逐漸降低。推測(cè)可能是在菌種生長(zhǎng)初期開始分泌胞外降解酶，水解玉米皮纖維，培養(yǎng)基中還原糖含量提高，但當(dāng)菌體生長(zhǎng)加快，菌株生長(zhǎng)加速利用培養(yǎng)基中還原糖，因此含量開始逐漸降低。裂褶菌表達(dá)分泌胞外酶是其降解、利用玉米皮纖維的主要途徑，當(dāng)培養(yǎng)基上清液中還原糖含量快速上升并達(dá)到最高點(diǎn)時(shí)，推測(cè)其纖維降解酶也同時(shí)在進(jìn)行高效地轉(zhuǎn)錄，因此選擇培養(yǎng)48 h為RNA提取時(shí)間。當(dāng)培養(yǎng)至72 h時(shí)，發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量、酶活力趨于穩(wěn)定，還原糖含量逐步降低，推測(cè)裂褶已經(jīng)開始利用培養(yǎng)基中已經(jīng)降解的纖維維持生長(zhǎng)，胞外酶的轉(zhuǎn)錄效率可能開始降低。發(fā)酵液中木聚糖酶酶活力隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高(圖2)，但超過72 h后，酶活力增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。其在48～72 h間酶活力增長(zhǎng)較快。發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高(圖3)，但超過60 h后，蛋白質(zhì)濃度增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。

圖1 發(fā)酵液中還原糖含量Fig.1 Reducing sugar content in fermentation

圖2 發(fā)酵液中木聚糖酶酶活力Fig.2 Activity of xylanase in fermentation

2.2 總RNA提取、測(cè)序及Unigene的組裝

提取了發(fā)酵培養(yǎng)48 h時(shí)的裂褶菌總RNA，經(jīng)過NanoDrop定量后，確定提取的總RNA濃度為395 ng/μL，260/280比值為2.07。提取的裂褶菌RNA完整，沒有彌散(圖4)，28S∶18S的比值符合構(gòu)建cDNA文庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量要求。

圖3 發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度變化Fig.3 Change of protein concentration in fermentation

圖4 裂褶菌總RNA電泳檢測(cè)Fig.4 The electrophoresis detection of maitake RNA

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾統(tǒng)計(jì)、拼接，組裝出全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本Unigene序列，共獲得23 656個(gè)Unigene，最長(zhǎng)為13 092 nt，最短為201 nt，Unigene序列的平均GC含量為0.589 7。

根據(jù)Unigene序列的長(zhǎng)度進(jìn)行分析，核酸序列長(zhǎng)度在200～400 nt之間的Unigene占比最多，而長(zhǎng)度在200～2 000 nt之間的占85.51%，為20 229個(gè)；長(zhǎng)度在2 000～3 000 nt之間的為2 210個(gè)，占比為9.34%；長(zhǎng)度大于3 000 nt的Unigene數(shù)為1 217個(gè)，占總數(shù)的5.14%。

2.3 Unigene的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析

Unigene序列分別與NR、NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，分別有7 281和1 559個(gè)能夠比對(duì)成功，占總數(shù)目的30.78%和6.59%。Unigene序列分別進(jìn)行BLASTP和BLASTX分析后，有7 353和7 084個(gè)能夠比對(duì)成功，占總數(shù)的31.08%和29.95%。分析顯示，共有5個(gè)作用于玉米皮半纖維素主鏈的木聚糖酶基因(表1)，分別屬于糖苷水解酶第10家族和第11家族，木聚糖酶基因在687～1 113 bp之間。玉米皮半纖維素的徹底降解需要多種酶的協(xié)同作用[18]，而半纖維素主鏈的降解同樣需要多種木聚糖酶的協(xié)同作用。有研究顯示，通過裂褶菌基因組測(cè)序分析能夠預(yù)測(cè)到6個(gè)木聚糖酶基因[19]，其中5個(gè)為糖苷水解酶的第10家族，1個(gè)為第11家族。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析預(yù)測(cè)木聚糖酶基因數(shù)量少于基因組測(cè)序分析數(shù)量，可能是由于在本研究的培養(yǎng)條件下，某些木聚糖基因沒有轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平低造成的。按序列同源性，木聚糖酶分別屬于糖苷水解酶第10家族、11家族和5家族，屬于同一家族的木聚糖酶催化區(qū)域具有同源性。第10家族的木聚糖酶分子量高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要作用于支鏈，通常生成較小的低聚糖；第11家族主要作用于主鏈，對(duì)木聚糖有很高的特異性；第5家族只作用于有阿拉伯糖集合的位點(diǎn)[20-21]。

表1 木聚糖酶基因序列分析Table 1 Analysis of xylanase gene sequence

裂褶菌能夠分泌表達(dá)多種半纖維素酶，并通過多種酶的協(xié)同作用將玉米皮纖維降解利用。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，裂褶菌還表達(dá)了多種半纖維素支鏈水解酶基因，包括木糖苷酶(β-xylosidase)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-arabinofuranosidase)、甘露糖苷酶(mannosidases)、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、酯酶(esterase)等。其中與木聚糖主鏈連接的阿拉伯糖基側(cè)鏈抑制了木聚糖水解酶的活性，而α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶能水解木聚糖的阿拉伯糖殘基，釋放阿拉伯糖分子，促進(jìn)半纖維素的降解[22]。根據(jù)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶氨基酸序列的相似性以及活性蛋白質(zhì)催化中心的結(jié)構(gòu)特征，將該酶歸為糖苷水解酶的第3、43、51、54、62和127家族[23]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示，裂褶菌能夠表達(dá)多種α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(表2)，共有6個(gè)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，分別屬于糖苷水解酶第43、51和62家族。目前已有研究表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶可同其他半纖維素酶協(xié)同作用，促進(jìn)半纖維素水解[24]，因此本研究設(shè)計(jì)克隆α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因Sabf32。

2.4 Unigene的注釋分類

通過GO注釋和GO功能分類分析，Unigene被注釋到生物過程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)3個(gè)部分，其中生物過程注釋23個(gè)條目、細(xì)胞組成注釋22個(gè)條目、分子功能注釋22個(gè)條目。

表2 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因序列分析Table 2 Analysis of α-L-arabinofuranosidase gene sequence

將Unigene的蛋白質(zhì)序列提交到NCBI，獲得與Unigene編號(hào)相對(duì)應(yīng)的COG編號(hào)，對(duì)COG每個(gè)類別Unigene的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。數(shù)量最多的是一般功能預(yù)測(cè)蛋白，其他較多的分類包括與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、糖類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯/核糖體結(jié)構(gòu)和發(fā)生、翻譯后修飾/蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化和伴侶有關(guān)的基因，根據(jù)基因數(shù)量分布繪制裂褶菌的Unigene COG分類圖(圖5)。

圖5 裂褶菌Unigene的COG分類Fig.5 COG functional classifications of maitake Unigene

2.5 Sabf32基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以裂褶菌cDNA為模版，PCR擴(kuò)增Sabf32基因的編碼序列，并進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序顯示Sabf32編碼序列全長(zhǎng)975 bp，編碼324個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子；信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析顯示，Sabf32的N端具有21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。通過BLASTX比對(duì)，Sabf32與來源于SchizophyllumcommuneH4-8的糖苷水解酶62家族蛋白(XP_003038505.1)具有最高一致性(100%)，目前還沒有關(guān)于該基因的研究報(bào)道。

根據(jù)Sabf32序列設(shè)計(jì)合成表達(dá)引物，以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得Sabf32基因片段(圖6)。

將基因片段Sabf32與表達(dá)載體pPIC9k分別進(jìn)行雙酶切；將純化后的片段鏈接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9k-Sabf32。測(cè)序確定序列正確后，將重組表達(dá)載體pPIC9k-Sabf32與空載體pPIC9k分別電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，通過α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶酶活力的測(cè)定篩選獲得陽(yáng)性重組子。

M-核酸分子量標(biāo)準(zhǔn); 1- Sabf32；2-pPIC9k載體圖6 Sabf32和pPIC9k載體雙酶切瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Fig.6 Agarose gel electrophoresis of Sabf32 and pPIC9k

2.6 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活力測(cè)定

挑取轉(zhuǎn)化pPIC9k-Sabf32的畢赤酵母，利用BMGY發(fā)酵培養(yǎng)，離心收集菌體后在BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。取發(fā)酵7 d后的發(fā)酵液的上清，進(jìn)行酶活力測(cè)定和SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖7)。重組酶Sabf32的相對(duì)分子量為32.5 kDa。

2.7 溫度和pH對(duì)重組Sabf32活性的影響

重組Sabf32的最適反應(yīng)溫度為40 ℃(圖8)，在40 ℃條件下有較好的穩(wěn)定性，在50 ℃條件下酶活力迅速降低，30 min后酶活完全喪失(圖9)。重組Sabf32的最適pH值為5.0，在pH 3.5～5.5的緩沖液中處理30 min，能保存80%以上的酶活(圖10)。在pH值低于2.5或高于7.0的緩沖液中處理30 min，酶活基本喪失(圖11)。

M-低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1-對(duì)照組；2-Sabf32誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵液；3-純化的酶液圖7 重組酶Sabf32的SDS-PAGE電泳檢測(cè)Fig.7 SDS-PAGE analysis of Sabf32

圖8 重組Sabf32的最適溫度Fig.8 The optimum temperature of Sabf32

圖9 重組Sabf32的溫度穩(wěn)定性Fig.9 The temperature stability of Sabf32

圖10 重組Sabf32的最適pHFig.10 The optimum pH of Sabf32

圖11 重組Sabf32的pH穩(wěn)定性圖Fig.11 The pH stability of Sabf32

2.8 比活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

經(jīng)測(cè)定重組阿拉伯呋喃糖苷酶Sabf32比酶活力為16.18 U/mg，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax分別為(3.98±0.32) mmol/L和(2.59±0.09) μmol/(min·mg)。Sabf32比酶活力低于TalaromycesleycettanusJCM12802來源的阿拉伯呋喃糖苷酶TlAbf51，其比酶活力達(dá)到1 068 U/mg[25]。

3 結(jié)論

通過測(cè)定發(fā)酵液中蛋白質(zhì)濃度、還原糖含量和木聚糖酶酶活力，確定了裂褶菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的取樣條件。其中發(fā)酵液中還原糖含量在48 h達(dá)到最高，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低；木聚糖酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而提高，在48～72h間酶活力增長(zhǎng)較快；蛋白質(zhì)濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高，但超過60 h增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。

提取了發(fā)酵培養(yǎng)48 h后的裂褶菌總RNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)分析后共獲得23 656個(gè)Unigene，平均GC含量為0.589 7。序列分析顯示，共有5個(gè)木聚糖酶基因，分別屬于糖苷水解酶第10家族和11家族；有6個(gè)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，分別屬于糖苷水解酶第43、51和62家族。此外，裂褶菌還表達(dá)了多種半纖維素支鏈水解酶基因，包括木糖苷酶、甘露糖苷酶、阿魏酸酯酶、酯酶等。

克隆了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因Sabf32，編碼序列全長(zhǎng)975 bp。Sabf32的N端具有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，與來源于SchizophyllumcommuneH4-8的糖苷水解酶62家族蛋白(XP_003038505.1)，具有最高一致性100%。完成了該酶在畢赤酵母表達(dá)，其最適溫度為40 ℃，最適pH值為4.0；在pH 3.5～5.5和40℃下較穩(wěn)定。Sabf32比酶活力為16.18 U/mg，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax分別為(3.98±0.32) mmol/L和(2.59±0.09) μmol/(min·mg)。本研究為進(jìn)一步開發(fā)玉米皮纖維降解酶以及多酶協(xié)同降解提供了基礎(chǔ)。