田雨思，衡小成，鄒偉,2，葉光斌,2*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

濃香型白酒是以窖池與酒醅為基礎(chǔ)，半開放式、多菌種協(xié)同固態(tài)發(fā)酵的方式進行生產(chǎn)。窖泥作為白酒釀造中的“微生物黃金”，其質(zhì)量對白酒品質(zhì)改善及特質(zhì)香氣的形成具有重要的影響。而窖泥微生物的種類、數(shù)量、群落構(gòu)成及代謝產(chǎn)物的多樣性對窖泥質(zhì)量以及窖泥微生態(tài)平衡有直接影響，進而影響濃香型白酒的品質(zhì)[1]。

窖泥微生物的種類繁多，包括細(xì)菌、放線菌、古生菌、霉菌和酵母菌等[2]。近年來的微生物生態(tài)學(xué)研究表明，窖泥中的細(xì)菌多樣性豐富，多達34個類。主要分布于14科及2個科級分類地位未知的梭菌綱和擬桿菌綱類群內(nèi)，并且大多細(xì)菌屬于嚴(yán)格厭氧細(xì)菌[3]。陶勇等[4]利用焦磷酸測序法研究了濃香型白酒不同窖齡窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性，發(fā)現(xiàn)有14個屬的優(yōu)勢微生物，其中有5個優(yōu)勢類群屬于梭菌綱，分別為Anaerobrancaceae、ClostridiumIV、Sedimentibacter、Ruminococcaceae及Syntrophomonas。胡曉龍等[5]通過高通量測序技術(shù)對窖泥微生物多樣性進行研究，提出乳桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬及甲烷菌是維持窖泥基本性能的主要微生物，且窖泥質(zhì)量與窖泥中優(yōu)勢梭菌菌群相對含量之間存在較好的正相關(guān)性。梭菌一直被認(rèn)為是影響濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)形成的重要菌體，對己酸、丁酸、己酸乙酯和丁酸乙酯等典型風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要作用，典型的有庫氏梭菌(C.kluyveri)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)和丁酸梭菌(C.butyricum)等[6-7]。

但是由于梭菌菌群專性厭氧，且沒有較為明確的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件導(dǎo)致可培養(yǎng)技術(shù)無法完全分離窖泥中的優(yōu)勢梭菌屬。此外梭菌屬本身是一個異源的分類類群，同屬不同種之間的16S rDNA序列相似度在88%～100%之間，造成梭菌屬的菌種在系統(tǒng)發(fā)育和表型特征上并不一致。目前對窖泥梭菌代謝產(chǎn)物研究主要集中在產(chǎn)己酸菌群的分離篩選[8-11]，對其他可培養(yǎng)梭菌代謝產(chǎn)物的研究較少。

本研究以川內(nèi)不同濃香型白酒酒廠的窖泥開展富集分離，結(jié)合16S rDNA序列分析和自動進樣-氣相色譜-質(zhì)譜法(SPME-GC-MS)對分離獲得的梭菌開展鑒定及產(chǎn)丁酸性能的研究。旨在豐富濃香型白酒梭菌資源，為濃香型白酒的風(fēng)味物質(zhì)研究和窖泥老熟、窖泥養(yǎng)護等研究提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

窖泥樣本取自川內(nèi)不同名優(yōu)酒廠老窖池，裝入?yún)捬醮?，用冰盒迅速運回實驗室，分別于4和-80 ℃冰箱保存。

富集培養(yǎng)基：MES 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，Na2SO45.0 g/L，NaCl 1.0 g/L，MgCl2·6H2O 0.4 g/L，NaHCO30.3 g/L，NH4NO30.3 g/L，無水CaCO30.15 g/L，酵母粉1.0 g/L，蛋白胨1.5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，可溶性淀粉5.0 g/L，乙酸鈉3.0 g/L，乳酸鈉3 mL/L，半胱氨酸鹽酸鹽1 g/L，窖泥浸提液20 mL/L，刃天青鈉鹽(厭氧指示劑)1 mg/L，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

強化梭菌培養(yǎng)基(RCM)[12](g/L)：蛋白胨10，酵母粉3，葡萄糖5，可溶性淀粉1，乙酸鈉3，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂粉20，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(同RCM液體)：添加刃天青鈉鹽(厭氧指示劑)1 mg/L。

1.2 儀器與設(shè)備

AW200SG厭氧工作站，金壇市科技分析儀器有限公司；HW326 恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；BF-2000M 氮吹儀，北京八方世紀(jì)科技有限公司；S1000 PCR儀，百樂科技有限公司；JY-600C 電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備公司；SC805 凝膠成像儀，上海山富科技儀器有限公司；7890A-5975B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫公司；Allegra 64R 高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；DM3000M 顯微鏡，德國徠卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 窖泥富集與厭氧梭菌的分離

1.3.1.1 窖泥富集

稱取10 g窖泥加入裝有10 mL無菌水的藍(lán)蓋瓶中，80 ℃恒溫水浴處理10 min，冷卻后以5%的接種量接種到除氧滅菌后的富集培養(yǎng)基中，于35 ℃富集培養(yǎng)1個月。

1.3.1.2 菌株的分離純化

采用稀釋涂布法分離富集液中的厭氧梭菌，將富集液分別稀釋至10-1～10-6，吸取10-3～10-6的菌液0.1 mL涂布于RCM平板(已在厭氧工作站除氧24 h)，于35 ℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。將具有不同形態(tài)特征的菌落進行再次劃線純化，獲得單菌落。

1.3.2 菌株的16S rDNA序列的測定與分析

1.3.2.1 DNA的提取

將純化后不同形態(tài)的單菌落接種至除氧后RCM液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)5 d，吸取2 mL培養(yǎng)液于無菌離心管中，13 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集菌體沉淀(共2～3次)。菌體沉淀使用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒并按操作步驟提取基因組DNA。

1.3.2.2 PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將1.3.2.1得到的DNA溶液作為擴增模板，采用細(xì)菌通用引物27F-1492R[13]進行PCR擴增，50 μL反應(yīng)體系：5×Buffer(含Mg2+)10 μL，200 μmol/L dNTPs 1 μL，正反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，模板DNA 3 μL，加無菌水補足至50 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送至成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司測序。

測序序列通過BioEdit剪切后，將可靠序列片段上傳至NCBI核酸比對網(wǎng)站進行比對，選取序列同源性最高的序列，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 代謝產(chǎn)物分析

使用無菌水將純化后的單菌落制成相同濃度的種子液，按5%接種量接種至除氧后50 mL RCM液體培養(yǎng)基中，35 ℃發(fā)酵5 d，取發(fā)酵液20 mL使用2 mol/L硫酸酸化至pH值為2，加無水乙醇定容至25 mL，12 000 r/min、4 ℃冷凍離心5 min，取上清液，過0.2 μm微孔濾膜[14]。進樣前加10 μL乙酸丁酯(84 mg/mL)作為內(nèi)標(biāo)混勻。

氣相色譜條件：DB-WAX(60 m×250 μm×0.25 μm)色譜柱；載氣為高純度He，流速1 mL/min，進樣口溫度230 ℃；升溫程序：初始溫度為60 ℃保持1 min，然后以8 ℃/min的升溫速率升至180 ℃保持2 min，再以15 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜(MS)條件：電子離子源(EI)，70 eV電子能量，采集模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～550 u，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃。

定性分析：質(zhì)譜圖通過與美國Agilent公司提供的美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(national institute of standards and technology，NIST)標(biāo)準(zhǔn)譜庫05a.L進行比對，選擇匹配度均>80進行定性分析[15]。

半定量分析：以乙酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)，測定樣品中酸類、酯類、醇類及芳香類化合物的峰面積與乙酸丁酯峰面積之比，再根據(jù)乙酸丁酯的質(zhì)量濃度來進一步計算其含量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥中厭氧梭菌的分離

通過菌落形態(tài)、顯微形態(tài)差異并結(jié)合生理生化特性研究，篩選獲得23株厭氧梭菌，后續(xù)對其進行分子鑒定。

2.2 菌株16S rDNA序列分析

對分離獲得的23株菌進行基因組DNA的提取和16S rDNA序列的擴增。將測定細(xì)菌的16S rDNA序列提交NCBI進行比對分析并下載參比序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，共有23株與Gen Bank中5種梭菌相關(guān)。

●-本次研究分離獲得的菌株；▲-近年來在IJSEM，Antonie Van Leeuwenhoek等雜志發(fā)表的窖泥來源的梭菌屬新種[17-20]；◆-鄭州輕工業(yè)大學(xué)等[21]報道的窖泥梭菌，其中Paraclostridium bifermentans ATCC 6381和[Clostridium] celerecrescens 18A不屬于嚴(yán)格意義上的梭菌屬微生物圖1 窖泥中梭菌的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Clostridium spp.from pit mud based on the 16S rDNA sequences

由圖1系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，5株代表菌株(2-1、3-3、TZ-2、B2-1′、5-20)分屬于拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)菌群、還原鉻梭菌(C.cochlearium)、丁酸梭菌(C.butyricum)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、廣西梭菌(C.guangxiense)，其中C.cochlearium和C.guangxiense是首次在窖泥中獲得分離，在一定程度上豐富了窖泥中梭菌物種的多樣性。

此外，從圖1系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出菌株2-1等11個梭菌菌株無法鑒定到種，它們與拜氏梭菌菌群的6個近似屬種(拜氏梭菌(C.beijerinckii)、C.diolis、C.saccharobutylicum、C.chromiireducens、C.puniceum、C.saccharoperbutylacetonicum)具有高于97%的相似度。表2為DNAMAN軟件對以上6個近似梭菌16S rDNA序列相似度的交叉分析表。由表1可知：C.beijerinckii與其他近似梭菌C.diolis、C.saccharobutylicum、C.chromiireducens、C.puniceum、C.saccharoperbutylacetonicum的16S rDNA序列相似度分別為97.7%、98.5%、97.9%、97.7%、98.0%，且表1中6種不同梭菌的交叉相似度均超過97%，現(xiàn)有的16S rDNA測序結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹分析難以將他們鑒定到種。由于現(xiàn)有的高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于濃香型白酒窖泥、糟醅等樣本的研究，其OTU分類是基于16S rDNA序列相似度，即相似度低于97%界定為不同OTU。因此對于16S rDNA序列相似度高于97%的近似屬種的高通量數(shù)據(jù)開展分析時，無疑會低估窖泥梭菌類群的生物多樣性。

表1 不同梭菌屬序列相似度交叉分析表 單位:%Table 1 Cross-analysis of sequence similarity of Clostridium

注：Clostridiumbeijerinckii菌株代表NCBI登錄號為NR.029230，Clostridiumdiolis菌株代表NCBI登錄號為NR.025542，Clostridiumsaccharobutylicum菌株代表NCBI登錄號為NR.122061，Clostridiumchromiireducens菌株代表NCBI登錄號為NR.122090，Clostridiumpuniceum菌株代表NCBI登錄號為NR.026105，Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum菌株代表NCBI登錄號為NR.036950。

此外，梭菌作為一類重要的窖泥功能微生物，目前還未見學(xué)者對窖泥內(nèi)梭菌類群的分布情況開展研究。圖1的系統(tǒng)發(fā)育樹展示了近年來純培養(yǎng)分離獲得的窖泥來源梭菌屬種的分布信息?？梢钥闯?，目前來源于窖泥的可培養(yǎng)梭菌微生物主要分布在梭菌屬cluster I(Clostridiumcluster I)即嚴(yán)格意義的梭菌屬(Clostridiumsensu stricto)類群的16個屬種和菌群組合內(nèi)，包括拜氏梭菌菌群(C.beijerinckiigroup)、丁酸梭菌(C.butyricum)、還原鉻梭菌(C.cochlearium)、C.aurantibutyricum、C.sartagoforme、C.thermopalmarium、窖泥梭菌(C.swellfunianum)、C.carboxidivorans、白酒梭菌(C.liquoris)、C.cochlearium、C.sporogenes、廣西梭菌(C.guangxiense)、老窖梭菌(C.fermenticellae)、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)、庫氏梭菌(C.kluyveri)、C.luticellarii。

2.3 菌株代謝產(chǎn)物分析

根據(jù)1.3.3方法對篩選梭菌風(fēng)味物質(zhì)進行分析，并與空白培養(yǎng)基相比較，結(jié)果見表2。

表2 分離菌株代謝產(chǎn)物分析結(jié)果 單位：mg/(100 mL)Table 2 Analysis results of metabolic products of isolated strains

續(xù)表2

菌株名稱酸類醇類酯類總酸甲酸丁酸乙酸總醇甲醇乙醇總酯丁酸乙酯醛類甘油3-4480.9—367.0113.94454.8—4454.8—3.0——JL3-4420.6—178.9241.76012.7192.65820.1————JL3-5953.019.1402.2531.78253.2—8142.9——108.526.23-3518.38.3228.7281.36645.7198.26447.5————TZ-2830.313.8381.0435.57290.2—7236.4————TZ-3676.212.6285.6378.06743.4—6743.4————TZ-4688.58.8306.3372.47195.1—7195.1————TZ-5644.97.7297.7339.56035.0—6035.0————TZ-91237.921.5576.8639.67822.7—7822.7——64.7—SZ-2319.6—149.6170.04260.0—4260.0194.0———SZ-8145.2——145.24201.2171.24030.0————3-8882.2—680.6201.66181.0—6181.05.15.1——空白————3015.6—3015.6————

注：本次研究以未接種的空白培養(yǎng)為對照，采用相同的處理方法處理樣本，并進行GC-MS分析，未對空白接種進行數(shù)據(jù)扣除。由于接種樣本的乙醇含量均高于空白樣本檢測值，表明接種樣本均能夠產(chǎn)乙醇;“—”表示未檢測出來。

由表2可知，23株梭菌的主要代謝物包括酸類、醇類、酯類及一些其他化合物，主要風(fēng)味物質(zhì)為丁酸等。其中菌株G3-5與3-8丁酸產(chǎn)量最高，分別可達601.9和680.6 mg/100 mL；TZ-9丁酸產(chǎn)量次之，約為576.8 mg/100 mL；丁酸產(chǎn)量在300～500 mg/100 mL的菌株從高到底依次為2-1、2-24、G3-1、G3-3、JL3-5、JL3-1、TZ-2、3-4、TZ-4；丁酸產(chǎn)量在300 mg/100 mL以下的菌株分別為TZ-5、TZ-3、5-20、3-3、2-11、JL3-4、B2-1′、SZ-2、SZ-8、4-30，其中SZ-8與4-30較為特殊，不產(chǎn)丁酸。結(jié)合16S rDNA鑒定結(jié)果，表明2-1、C2-2、G3-1、G3-3、G3-5、JL3-1、4-30、2-11、2-24與3-4同屬于拜氏梭菌菌群，但其發(fā)酵代謝產(chǎn)物丁酸的產(chǎn)量卻存在明顯的差異。除此之外，B2-1′、G3-3、JL3-1、4-30、2-11、JL3-4、3-3代謝產(chǎn)物中含有較高的甲醇，4-30產(chǎn)量最高，可達282.1 mg/100 mL。2-1、C2-2、G3-1、G3-3、G3-5、JL3-1、3-4、3-8同屬拜氏梭菌菌群，發(fā)酵能夠產(chǎn)生一定量的丁酸乙酯。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)分離方法從濃香型白酒窖泥中分離得到23株厭氧梭菌，分別與5類梭菌—拜氏梭菌菌群、丁酸梭菌、還原鉻梭菌、酪丁酸梭菌、廣西梭菌具有較高的同源性，其中首次報道了廣西梭菌和還原鉻梭菌在窖泥中的存在。通過對不同梭菌菌株的代謝產(chǎn)物的分析，檢測到包括酸類、醇類、酯類等16類化合物，且主要代謝產(chǎn)物為丁酸。不同梭菌菌株在產(chǎn)丁酸能力上具有顯著差異。其中，菌株TZ-9綜合產(chǎn)酸能力最強，菌株3-8產(chǎn)丁酸能力最強。通過對窖泥中厭氧梭菌的分離鑒定及代謝產(chǎn)物分析，能夠初探窖泥優(yōu)勢梭菌菌株的組成，為后續(xù)其在白酒釀造過程中的功能性研究提供菌種資源。