張震，熊海波，徐慶陽,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津，300457) 3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

L-色氨酸為8種必需氨基酸之一，在人體代謝過程中發(fā)揮著不可替代的重要作用，故又被稱為第二必需氨基酸[1]。它可以促進人和動物的生長發(fā)育，調節(jié)其新陳代謝水平和生理功能，促進消化，提高機體免疫力，因而被廣泛用于食品、醫(yī)藥、飼料和農業(yè)等行業(yè)，在氨基酸生產中占有重要地位[2-3]。微生物直接發(fā)酵法是當前L-色氨酸生產的主流方法，該法利用性能優(yōu)越的工程菌株生產色氨酸，其中大腸桿菌應用較多[4-5]。

在工程菌的大規(guī)模發(fā)酵過程中，外源基因表達水平以及菌體密度決定了重組異源蛋白產物的宏觀合成量[6]。從理論上說，在維持外源基因表達水平不變的前提下，提高工程菌的發(fā)酵密度可以大幅度提高目的產物產量，提高發(fā)酵效率，降低生產成本[7]。而大腸桿菌工程菌的高密度培養(yǎng)技術(high cell density cultivation, HCDC)為解決這一需要應運而生。但是，限制大腸桿菌高密度培養(yǎng)的因素有很多，如宿主菌類型、培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)方式、發(fā)酵條件控制、抑制性副產物的積累等[9-11]。因此除應用目的產物高產工程菌外，確定合適的發(fā)酵工藝并對工程菌株發(fā)酵條件進行優(yōu)化是提高發(fā)酵水平的有效手段之一。其中，發(fā)酵接種量和底物磷酸鹽添加量是2個重要的限制性因素[8, 12]，二者直接影響工程菌的生長和目的產物的合成，從而影響整體發(fā)酵質量。

本研究在大腸桿菌發(fā)酵產L-色氨酸時，通過梯度試驗先后對發(fā)酵接種量和底物磷酸鹽添加量進行了優(yōu)化，大幅提高了菌體最高密度及L-色氨酸產量，實現(xiàn)了較高水平的大腸桿菌高密度培養(yǎng)，為大腸桿菌高密度培養(yǎng)在L-色氨酸發(fā)酵中的應用提供了新思路。同時，對底物磷酸鹽添加量對發(fā)酵的影響進行了著重分析，為L-色氨酸發(fā)酵生產中底物磷酸鹽的調控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

L-色氨酸工程菌EscherichiacoliTRTH (trpEDCBA+TetR)，由天津科技大學代謝工程研究室提供。

1.2.1 活化培養(yǎng)基

酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，瓊脂粉20 g/L，四環(huán)素20 mg/L。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖40 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸0.5 g/L， (NH4)2SO41 g/L，KH2PO45 g/L，VB11 mg/L，VH0.3 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，微量元素混合溶液0.2%(體積分數(shù)),參照楊夢晨[13]的方法配制。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖10 g/L，酵母粉4 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO44 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 75 mg/L，VB15 mg/L，VH0.2 mg/L，微量元素混合溶液0.2%(體積分數(shù))。

注：對于底物KH2PO4添加量梯度試驗，除KH2PO4分別改為相應濃度外，其他成分均與上述發(fā)酵培養(yǎng)基一致。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠； 5 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；30 L不銹鋼機械攪拌發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；TU 1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；LC20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；S-433D氨基酸分析儀，德國賽卡姆公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取甘油管中菌種接種于斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，傳代2次，每代培養(yǎng)12 h。

1.4.2 5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：利用5 L發(fā)酵罐進行種子培養(yǎng)，初始發(fā)酵液體積定容至3 L。初始通氣量為2 L/min，初始攪拌轉速為200 r/min，通過自動流加25%(質量濃度)的氨水控制發(fā)酵液pH值在7.0～7.2之間， 37 ℃培養(yǎng)，通過攪拌和通風控制溶氧，維持在250～350 mg/L之間，培養(yǎng)至細胞干重達到5～6 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)：參照程立坤等[14]的方法，利用5 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)，初始發(fā)酵液體積定容至3 L。通過自動流加25%(質量濃度)的氨水控制培養(yǎng)基pH值在7.0～7.2之間，控制溶氧在250～400 mg/L，發(fā)酵過程中以泡敵消泡。底物葡萄糖消耗完后，根據(jù)DO反饋補料策略，流加質量濃度為800 g/L的葡萄糖溶液，維持零殘?zhí)前l(fā)酵[15]。過程中每隔2 h測樣、記錄數(shù)據(jù)。

1.5 試驗方法

1.5.1 接種量梯度控制發(fā)酵

當種子培養(yǎng)至細胞干重達到5～6 g/L時，分別按10%、15%、20%、25%(體積分數(shù))接種量接入到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行發(fā)酵對比試驗，以菌體密度和產量為評價標準，選擇最優(yōu)結果。

1.5.2 底物磷酸鹽梯度添加控制發(fā)酵

在最適接種量的基礎上，以KH2PO4添加量作為變量，在不同批次發(fā)酵實驗的底物中分別添加6、8、10、12 g/L KH2PO4，其他培養(yǎng)條件不變，進行發(fā)酵對比試驗，以綜合表現(xiàn)為評價標準，選擇最優(yōu)結果。

1.6 檢測方法

1.6.1 pH值測定

采用Hamilton pH電極在線檢測，精密試紙(pH 6.4～8.0)輔助檢測。

1.6.2 菌體生物量測定

菌體密度以菌體干重表示，取10 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心2 min，將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80 ℃干燥至恒重后用分析天平稱重。

1.6.3L-色氨酸含量測定

采用高效液相色譜法檢測L-色氨酸含量。具體方法見參考文獻[11]。

1.6.4 有機酸副產物含量測定

采用高效液相色譜法檢測有機酸含量。色譜柱Aminex HPX-87H Column(300 mm×7.8 mm)；流動相5 mmol/L H2SO4；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；紫外檢測波長215 nm。

1.6.5 氨基酸副產物含量測定

采用德國賽卡姆公司氨基酸分析儀(S-433D)進行測定，具體方法見參考文獻[16]。

1.6.6 磷酸鹽含量的測定[17]

磷酸鹽含量測定采用田康明等[17]的方法，采用江蘇銳陽生物科技有限公司磷酸鹽快速檢測試劑盒進行測定。

1.7 分析方法

1.7.1 糖酸轉化率計算

糖酸轉化率SA根據(jù)公式(1)計算：

(1)

式中：ρ，L-色氨酸質量濃度，g/L；V，發(fā)酵液總體積，L；m，總耗糖量，g。

1.7.2 菌體比生長速率[18]

菌體比生長速率μ定義為單位質量菌體的瞬時增量，根據(jù)李會等[18]的研究，用公式(2)計算:

(2)

式中：X，x，菌體量，g/L；t，時間，h；μ，菌體比生長速率，h-1。

所有試驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。利用軟件IBM SPSS Statistics 25進行分析，來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 接種量梯度發(fā)酵試驗結果分析

為探究提高接種量對菌體生長和產酸的影響，設置10%、15%、20%、25%(體積分數(shù))四個接種量梯度，并以10%(體積分數(shù))(初始發(fā)酵工藝)作為對照組，進行發(fā)酵對比試驗，檢測菌體在發(fā)酵過程中的菌體密度與產量變化并繪制L-色氨酸合成速率曲線，結果如圖1、2所示。

圖1 接種量對菌體密度和L-色氨酸產量的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on cell density and L-tryptophan production注：圖1中空心圖標為菌體密度，實心圖標為L-色氨酸產量。

圖2 接種量對L-色氨酸合成速率的影響Fig.2 Effects of inoculation amount on the rate of L-tryptophan synthesis

由圖1可知，發(fā)酵延滯期隨著接種量的增加逐漸縮短，接種量提高到20%(體積分數(shù))，發(fā)酵延滯期縮短至2 h以內；接種量繼續(xù)提高至25%(體積分數(shù))，發(fā)酵延滯期幾乎消失，菌體快速進入對數(shù)生長期。同時，接種量從10%逐步提高到20%(體積分數(shù))，最高菌體密度從44.79 g/L增加到47.76 g/L，有小幅增長(P<0.05)；最終L-色氨酸產量分別為45.30 g/L與47.71 g/L，無顯著差異(P>0.05)。接種量繼續(xù)增加到25%(體積分數(shù))時，最高菌體密度及最終L-色氨酸產量分別為47.07 g/L與46.51 g/L，與20%(體積分數(shù))時相比沒有明顯提升，且發(fā)酵中后期菌體活力開始衰弱，菌體密度呈明顯下降趨勢。另外，從L-色氨酸合成速率(圖2)來看，20%(體積分數(shù))接種量時，發(fā)酵表現(xiàn)出更強的單位產酸能力，最高L-色氨酸合成速率為1.92 g/(L·h)，遠高于對照發(fā)酵的1.67 g/(L·h)，產酸高峰期維持時間(6～30 h)也較長，這更有利于色氨酸的大量積累和實現(xiàn)菌體高密度培養(yǎng)。

分析可知，接種量影響菌體的適應能力和生長速率，是影響大腸桿菌高密度發(fā)酵的關鍵因素之一。種子液中含有大量的胞外水解酶，能促進菌體快速分解利用底物[19]，接種量的增加使這些酶的量也相應增加，因此在營養(yǎng)物質充足的條件下，較大的接種量能強化菌體對新環(huán)境的適應能力，縮短延滯期，增強菌體活力，提高生長、產酸效率，為菌體的高密度培養(yǎng)打下良好基礎。但同時，接種量過高可能會導致菌體生長過快，在發(fā)酵后期容易發(fā)生菌體自溶、迅速老化的情況，給發(fā)酵帶來不利影響。綜合考慮，選擇20%(體積分數(shù))作為接種量最優(yōu)值，繼續(xù)下一步優(yōu)化。

2.2 底物磷酸鹽梯度添加控制發(fā)酵試驗結果分析

2.2.1 底物中KH2PO4添加量對菌體密度和產酸的影響

在接種量提高到20%(體積分數(shù))的基礎上，對底物K2HPO4添加量設置6、8、10、12 g/L四個梯度進行發(fā)酵對比試驗，測定菌體在發(fā)酵過程中的菌體密度與產酸變化，計算并繪制比生長速率與L-色氨酸合成速率曲線，結果如圖3所示。

由圖3-a可知，隨著底物KH2PO4添加量的提高，最高菌體密度逐漸增加，并在底物KH2PO4為12 g/L時達到峰值，為67.92 g/L，較底物KH2PO46 g/L(47.43 g/L)時提高了43.20%；最終L-色氨酸產量先增加，在底物KH2PO4為10 g/L時達到最高，為59.55 g/L，較6 g/L KH2PO4(47.49 g/L)時提高25.39%，之后開始下降。同時，從比生長速率μ(圖3-b)和L-色氨酸合成速率(圖3-c)來看，底物KH2PO4濃度的增加使菌體活力更加旺盛，前期生長速度明顯加快，μmax也隨之提高，并在12 g/L KH2PO4時達到最高，為0.53 h-1，較6 g/L KH2PO4時(0.34 h-1)提高了55.88%；10 g/L KH2PO4時，菌體表現(xiàn)出更持久的高單位產酸能力，其最高L-色氨酸合成速率為2.47 g/(L·h)，較6 g/L KH2PO4時的1.87 g/(L·h)提高了46.52%，整體產酸水平隨之大幅提升。

圖3 不同KH2PO4添加量對菌體密度(a)、比生長速率(b)、L-色氨酸合成速率(c)的影響Fig.3 Effects of different KH2PO4 additions on cell density(a), specific growth rate(b),the rate of L-tryptophan synthesis(c)注：圖3(a)中空心圖標為菌體密度，實心圖標為L-色氨酸產量。

2.2.2 底物KH2PO4添加量對發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗的影響

圖4 底物KH2PO4添加量對發(fā)酵過程中磷酸鹽消耗的影響Fig.4 Effect of substrate KH2PO4 addition on phosphate consumption during fermentation

表1 不同KH2PO4添加量對每4 h內平均消耗速率的影響 單位：mmol/(L·h)Table 1 Effects of different KH2PO4 additions on average consumption rate of s every 4 h

2.2.3 底物中KH2PO4添加量對發(fā)酵耗糖和糖酸轉化率的影響

發(fā)酵結束后，計算并繪制補糖速率與糖酸轉化率過程曲線，結果如圖5所示。由圖5-a可知，底物KH2PO4為由6 g/L增加至12 g/L，最高補糖速率由13.06 g/(L·h)提升至15.51 g/(L·h)，菌體糖代謝水平顯著提升。同時，就糖酸轉化率(圖5-b)而言，底物KH2PO4為10 g/L時的糖酸轉化率在整個發(fā)酵周期內均處于較高水平，其峰值達到了21.35%，較6 g/L KH2PO4時(18.82%)提高了13.44%，更多的碳源流向了目的產物，原料利用率大幅提高。

圖5 不同KH2PO4添加量對補糖速率(a)和糖酸轉化率(b)的影響Fig.5 Effects of different KH2PO4 additions on glucose feeding rate (a) and glucose conversion rate (b)

2.2.4 底物中KH2PO4添加量對發(fā)酵副產物的影響[20]

發(fā)酵結束后，對主要抑制性副產物乙酸、乳酸及丙氨酸最終含量進行檢測，結果如圖6所示?？芍孜颣H2PO4添加量由6 g/L提高至10 g/L，各副產物積累量均有小幅上漲，但整體差異不大，且都處于合理水平，不會對發(fā)酵造成負面影響；底物KH2PO4添加量繼續(xù)增加至12 g/L時，3種副產物積累量均大幅增加，其中，乙酸和乳酸均超過5 g/L，菌體代謝異常，正常生長受到嚴重影響[11]，進而出現(xiàn)糖酸轉化率降低、產品質量下降、提取難度加大等一系列問題。

圖6 不同KH2PO4添加量對發(fā)酵副產物的影響Fig.6 Effects of different KH2PO4 additions on fermentation by-products

3 結論

在大腸桿菌的高密度發(fā)酵中，接種量和底物磷酸鹽添加量是2個重要的限制性因素，二者直接影響最終發(fā)酵結果。本試驗利用梯度試驗先后對發(fā)酵接種量及底物KH2PO4添加量進行了優(yōu)化，最終確定最佳接種量為20%(體積分數(shù))，底物KH2PO4添加量為10 g/L。試驗結果表明，在優(yōu)化后的條件下，底物磷酸鹽能被菌體充分有效利用，發(fā)酵整體糖代謝水平提升，細胞生長和目的產物表達得到促進，最高菌體密度達到65.39 g/L，最終L-色氨酸產量為59.55 g/L，分別較優(yōu)化前(10%(體積分數(shù))接種量，6 g/L KH2PO4)的44.79 g/L(最高菌體密度)和45.30 g/L(最終L-色氨酸產量)，增加了45.99%和31.17%，設備利用率大幅提高。同時，由于延滯期的縮短和生長期的提前優(yōu)化后的發(fā)酵批次在24 h左右就達到了優(yōu)化前40 h時的產酸水平(45.30 g/L)，在原有產酸指標不變的情況下，壓縮了發(fā)酵周期，降低了時間成本，極大提高了發(fā)酵效率。