王開(kāi)方，潘龍，刁文嬌，陳旭升，毛忠貴

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由25～35個(gè)L-賴氨酸單體通過(guò)ε-氨基和α-羧基脫水縮合形成的一種同型氨基酸聚合物[1-2]。ε-PL具有抑菌范圍廣[3-4]、安全無(wú)毒[5]和熱穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，故廣泛用作食品防腐劑，目前已被多個(gè)國(guó)家使用[6-7]。

ε-PL的發(fā)酵工藝主要為pH控制策略。KAHAR等[8]開(kāi)創(chuàng)了兩階段pH控制策略，即發(fā)酵前期(2 d)將pH控制在5.0以上，獲得更高的菌體量；后期將pH控制在4.0左右，快速合成ε-PL。經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d補(bǔ)料分批發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到48.3 g/L，成為當(dāng)時(shí)的領(lǐng)先水平。任喜東等[9]建立了一種pH沖擊策略發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL模式。前期控制pH為5.0，隨后讓pH自然下降，經(jīng)12 h左右的沖擊(pH 3.0)后回調(diào)pH值至4.0左右，直至發(fā)酵結(jié)束。同樣經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d補(bǔ)料分批發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到54.7 g/L。大量研究表明，發(fā)酵過(guò)程中將pH控制在4.0左右是S.albulus積累ε-PL的先決條件[8，10-11]。目前，關(guān)于低pH促進(jìn)S.albulus高產(chǎn)ε-PL的原因主要有2種觀點(diǎn)，第1種觀點(diǎn)認(rèn)為，低pH能夠有效的抑制ε-PL降解酶(PL dehydrogenase, Pld)的酶活，防止產(chǎn)生的ε-PL被降解[12-13]；第2種觀點(diǎn)認(rèn)為，ε-PL合成酶(PL synthetase, Pls)是一種依賴于ATP的非核糖體肽合成酶，低pH環(huán)境有利于胞內(nèi)ATP的積累，從而促進(jìn)ε-PL的合成[14]。

然而，低pH除了影響Pld酶活和胞內(nèi)ATP濃度之外，還會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)速率產(chǎn)生影響[15]，而生長(zhǎng)速率的不同又會(huì)影響微生物的代謝流分布[16-17]。王澤建等[18]研究發(fā)現(xiàn)：在糞產(chǎn)堿桿菌中，隨著比生長(zhǎng)速率的升高(0.05 h-1到0.29 h-1)，葡萄糖流向菌體生長(zhǎng)的比例從18%增加到了47%，流向凝膠多糖合成的碳去向分布由45%降低到了12%；在高比生長(zhǎng)速率的情況下，更多的碳源流向菌體的生長(zhǎng)以及副產(chǎn)物的生成。那么比生長(zhǎng)速率是否也是影響ε-PL合成的一個(gè)重要原因呢？目前關(guān)于菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)ε-PL合成的影響尚未有研究報(bào)道。因此，本研究將通過(guò)恒化培養(yǎng)方式，研究不同pH和菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)S.albulusM-Z18合成ε-PL的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

StreptomycesalbulusM-Z18，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

ATP檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)，碧云天生物技術(shù)公司；ε-PL標(biāo)準(zhǔn)品，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；葡萄糖(優(yōu)級(jí)純)，西王藥業(yè)有限公司鄒平分公司；酵母粉，英國(guó)Oxoid公司；其他試劑(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(BNT)(g/L)：葡萄糖 10，酵母粉 1，魚(yú)粉蛋白胨 2，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基(M3G培養(yǎng)基)(g/L)：葡萄糖 50，酵母粉 5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.04，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，KH2PO41.36，K2HPO40.8，pH 6.8。

分批培養(yǎng)基(RSM培養(yǎng)基)(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉 10，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.8， FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO44，pH 6.8。

恒化分批培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，其他成分與分批培養(yǎng)基相同。

恒化補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖22，其他成分與分批培養(yǎng)基相同。

1.1.4 儀器與設(shè)備

T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應(yīng)器，迪比爾生物工程(上海)有限公司；BT100-1F/DG蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司；Synergy H4多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；UV-2100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼可儀器有限公司；AB204-N分析天平，瑞士梅特勒公司；3K15冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；HYG-Ⅱ回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；BS1100+電子天平，上海友聲衡器有限公司；GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱，上海光都儀器設(shè)備公司；SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 搖瓶種子培養(yǎng)

從活化的新鮮平板上刮取2環(huán)孢子接入裝有80 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，200 r/min、30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.2 分批發(fā)酵

將培養(yǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)8%接種量接入T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應(yīng)器，裝液量為600 mL，溫度設(shè)置為30 ℃，通氣量1.0 vvm，初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，溶氧設(shè)置為30%，轉(zhuǎn)速溶氧聯(lián)動(dòng)控制。待pH分別自然下降至3.5、4.0、5.0和5.5時(shí)，用12.5%的NH3·H2O分別維持pH恒定直至發(fā)酵結(jié)束。期間每隔6 h取一次樣，測(cè)定菌體干重(DCW)、ε-PL濃度、葡萄糖濃度等參數(shù)，以考察不同pH控制模式對(duì)S.albulusM-Z18生長(zhǎng)以及ε-PL合成的影響。

1.2.3 恒化培養(yǎng)

恒化培養(yǎng)在T&J-Miniskid 1 L*4迷你平行生物反應(yīng)器中進(jìn)行，工作體積為600 mL，接種量為8%。分批階段：初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，溶氧設(shè)置為30%，轉(zhuǎn)速溶氧聯(lián)動(dòng)控制，直至葡萄糖基本耗完(18 h)，轉(zhuǎn)入恒化階段[19]。恒化階段：全程控制溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為700 r/min，通氣量為1.0 vvm，分別控制pH為4.0、5.0和5.5，置換4～5個(gè)體積后均能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(通過(guò)葡萄糖濃度、菌體干重、溶氧、ε-PL濃度等過(guò)程參數(shù)確定)。取穩(wěn)定狀態(tài)菌液進(jìn)行分析。

1.3 分析方法

1.3.1 ε-PL濃度的測(cè)定

采用甲基橙比色法[20]。

1.3.2 DCW的測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液，5 000×g離心10 min后，棄上清，沉淀用去離子水洗滌、離心2次后，于105 ℃烘干至恒重(約24 h)。

1.3.3 葡萄糖濃度的測(cè)定

使用生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 胞內(nèi)ATP濃度的測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.5 蛋白濃度的測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算[18，21-22]

比生長(zhǎng)速率：使用Origin 9.0軟件按照Logistic方程非線性擬合得到生長(zhǎng)曲線，再經(jīng)Origin 9.0軟件進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)得出比生長(zhǎng)速率曲線。

ε-PL比合成速率：方法類(lèi)似于比生長(zhǎng)速率。

恒化穩(wěn)態(tài)時(shí)，比生長(zhǎng)速率(μ，h-1)、稀釋率(D，h-1)、細(xì)胞得率(YX/S，g/g)、ε-PL得率(YP/S，g/g)、以菌體生長(zhǎng)為基準(zhǔn)的ε-PL得率(YP/X，g/g)、葡萄糖比消耗速率(qS，g/(g·h)以及ε-PL比合成速率(qP，g/(g·h)參照以下公式。

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

qP=μ·YP/X

(6)

式中：F，補(bǔ)料速率，L/h；V，裝液量，0.6 L；c(X)，穩(wěn)態(tài)時(shí)菌體干重，g/L；c(P)，穩(wěn)態(tài)時(shí)ε-PL質(zhì)量濃度，g/L；c(S)，穩(wěn)態(tài)時(shí)葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；c(S0)，補(bǔ)料液中的葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)S. albulus M-Z18分批發(fā)酵的影響

微生物的生長(zhǎng)需要一定的酸堿度，鏈霉菌的最適生長(zhǎng)pH為中性偏堿性[23-24]。pH通過(guò)影響微生物細(xì)胞膜的電荷、酶活、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的解離等進(jìn)而影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[25]。pH對(duì)S.albulusM-Z18分批發(fā)酵結(jié)果如圖1所示，隨著分批發(fā)酵進(jìn)行，pH值由初始6.8逐步下降至pH 5.5(13 h)、pH 5.0(14 h)、pH 4.0(14.5 h)和pH 3.5(15 h)，隨后依靠自動(dòng)流加氨水將分批發(fā)酵過(guò)程控制在不同的pH進(jìn)行。由圖1-a可知，不同pH對(duì)S.albulusM-Z18菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著影響，受控pH越高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體量就越高，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究保持一致[18]。pH 3.5時(shí)，最終生物量為(11.62±0.40)g/L，僅為pH 5.5時(shí)的一半[(22.53±0.42 g/L]。另外，在分批發(fā)酵分別達(dá)到受控pH值后(15 h)，μpH 3.5約為0.04 h-1，μpH4.0約為0.07 h-1，μpH 5.0約為0.10 h-1，μpH 5.5約為0.13 h-1(圖1-b)，表明分批發(fā)酵受控pH, pH值越小，S.albulusM-Z18比生長(zhǎng)速率越低。然而，ε-PL產(chǎn)量在pH 3.5時(shí)最高，達(dá)到(5.24±0.10) g/L；當(dāng)pH高于5.0時(shí)，發(fā)酵液中檢測(cè)不到ε-PL(圖1-c)。通過(guò)對(duì)ε-PL比合成速率分析發(fā)現(xiàn)，ε-PL快速合成階段主要集中于18～27 h左右。24 h之后，ε-PL比合成速率顯著下降。在大部分時(shí)間里，pH 3.5時(shí)ε-PL比合成速率高于pH 4.0時(shí)(圖1-d)。因此，S.albulusM-Z18在低pH環(huán)境下積累ε-PL與菌體生長(zhǎng)速率存在一定關(guān)聯(lián)。

a-菌體生長(zhǎng)；b-比生長(zhǎng)速率；c-ε-PL產(chǎn)量；d-ε-PL比合成速率圖1 pH值對(duì)分批發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的影響Fig.1 Time profiles during batch fermentation at different pH

2.2 pH對(duì)S. albulus M-Z18恒化培養(yǎng)積累ε-PL的影響

恒化培養(yǎng)可以通過(guò)改變稀釋率及限制性基質(zhì)的種類(lèi)和濃度靈活地控制微生物細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率。通過(guò)恒化培養(yǎng)可以使微生物細(xì)胞達(dá)到“穩(wěn)態(tài)”，故常常被用于微生物生理方面的研究[26-27]。本文通過(guò)控制D=0.04 h-1，研究不同pH(4.0，4.5，5.0)對(duì)S.albulusM-Z18合成ε-PL的影響(在稀釋率為0.04 h-1時(shí)，pH 3.5不能建立恒化體系)，如圖2a-c所示，隨著pH值升高，S.albulusM-Z18生物量逐漸增大，而ε-PL質(zhì)量濃度逐漸減小。在pH 4.0時(shí)，生物量為(8.19±0.05) g/L，ε-PL濃度為(2.43±0.04) g/L；在pH 5.0時(shí)，生物量為(12.19±0.14) g/L，ε-PL質(zhì)量濃度為(0.76±0.02) g/L；在pH 5.5時(shí)，生物量為(15.63±0.09) g/L，ε-PL質(zhì)量濃度為0 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值對(duì)于恒化條件下的菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成影響，與上述分批發(fā)酵結(jié)果基本一致：低pH有利于ε-PL合成，而不利于菌體生長(zhǎng)。進(jìn)一步動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著pH值降低，細(xì)胞得率(YX/S)逐漸減小，葡萄糖比消耗速率(qS)逐漸增大，ε-PL比合成速率(qP)也逐漸增加。特別是在pH 4.0時(shí)，YX/S最低(0.376 g/g)，qS最高(0.106 g/(g·h))，qP最大(0.012 g/(g·h))(表1)。這表明，低pH時(shí)，細(xì)胞會(huì)快速消耗葡萄糖用于ε-PL的合成。胞內(nèi)ATP濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖2-d)，在pH 4.0時(shí)，胞內(nèi)ATP濃度最高為(7.11±0.80) nmol/mg蛋白，而pH 5.0與pH 5.5胞內(nèi)ATP濃度分別只有(4.23±0.43) 和(2.66±0.70) nmol/mg蛋白。這表明，pH值越低越有利于胞內(nèi)ATP積累。事實(shí)上，ε-PL合成依靠的ε-PL合成酶是一種依賴于ATP濃度的非核糖體肽合成酶，即ATP濃度越高，酶活越高[14]，ε-PL合成速率就越快。另外，已有的研究表明S.albulus中存在2種ε-PL分解酶，它們的最適pH為7.0左右，且酶活會(huì)隨著pH降低而逐漸減小，在pH 4.0時(shí)酶活基本喪失[12-13]。綜上，在菌體比生長(zhǎng)速率相同情況下，低pH一方面抑制了分解酶活性，另一方面使得底物葡萄糖更多地用于ATP和ε-PL合成，從而有利于ε-PL積累。

a-pH 4.0；b-pH 5.0；c-pH 5.5；d-胞內(nèi)ATP含量圖2 S. albulus M-Z18在不同pH下的恒化培養(yǎng)(D=0.04 h-1)過(guò)程參數(shù)和胞內(nèi)ATP含量Fig.2 Time profiles and intracellular ATP concentrations of S. albulus M-Z18 in chemostat (D=0.04 h-1) at different pH

表1 不同pH值下S. albulus M-Z18恒化培養(yǎng)(D=0.04 h-1)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic paraments of S. albulus M-Z18 in chemostat (D=0.04 h-1) at different pH

2.3 比生長(zhǎng)速率對(duì)恒定pH 4.0條件下S. albulus M-Z18合成ε-PL的影響

S.albulusM-Z18在pH 4.0條件下，不同稀釋率的恒化培養(yǎng)體系中達(dá)到“穩(wěn)態(tài)”時(shí)(D=0.08 h-1有輕微洗脫現(xiàn)象)，μ=0.04、0.06和0.08 h-1的生物量分別為(8.19±0.05)、(7.83±0.04)和(6.81±0.07) g/L；ε-PL濃度分別為(2.43±0.04)、(2.29±0.06)和(1.68±0.06) g/L(圖3a-c)。隨著菌體比生長(zhǎng)速率的增加(稀釋率升高)，qS和qP均呈逐漸增加趨勢(shì)(表2)。相比于D=0.04 h-1、D=0.06 h-1時(shí)，qS和qP分別提高了43%和50%；相比于D=0.06 h-1、D=0.08 h-1時(shí)，qS提高了70%，而qP只提高了11%。

表2 不同稀釋率S. albulus M-Z18恒化培養(yǎng)(pH 4.0)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic paraments of S. albulus M-Z18 in chemostat (pH 4.0) at different dilution ratios

另外，不同稀釋率恒化體系中菌體胞內(nèi)ATP濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，稀釋率為0.04、0.06和0.08 h-1時(shí)，胞內(nèi)ATP濃度分別為(7.11±0.80)、(12.98±0.45)和(16.06±1.41) nmol/mg蛋白。相比于D=0.04 h-1、D=0.06 h-1胞內(nèi)ATP增加了82.5%左右，約6 nmol/mg蛋白。而相比于D=0.06 h-1、D=0.08 h-1胞內(nèi)ATP僅增加了23.7%，約3 nmol/mg蛋白。綜上，在恒定pH 4.0時(shí)，菌體比生長(zhǎng)速率越高，底物葡萄糖消耗速率、ε-PL比生成速率和胞內(nèi)ATP濃度就越大，而細(xì)胞得率和ε-PL得率(YP/S)卻在總體下降。由此可以看出，隨著菌體比生長(zhǎng)速率提高，底物葡萄糖消耗速率加快，更多的葡萄糖流向了菌體合成和ATP生產(chǎn)，但是ε-PL比生成速率提高不顯著，而YP/S下降明顯(特別是在D=0.08 h-1時(shí))，故過(guò)高的菌體比生長(zhǎng)速率會(huì)降低發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，除了將pH控制在合適范圍內(nèi)，也需要調(diào)節(jié)菌體的生長(zhǎng)速率保持在合理區(qū)間(如0.06 h-1左右)，才能實(shí)現(xiàn)ε-PL的最高效發(fā)酵。

a-0.04 h-1；b-0.06 h-1；c-0.08 h-1；d-胞內(nèi)ATP含量圖3 S. albulus M-Z18在不同稀釋率的恒化培養(yǎng)(pH=4.0)過(guò)程參數(shù)和胞內(nèi)ATP含量Fig.3 Time profiles and intracellular ATP concentrations of S. albulus M-Z18 in chemostat (pH 4.0) at different dilution ratios

3 結(jié)論

為了探究ε-PL發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵影響因素，本文從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)角度，分析了pH值和菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)ε-PL發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的影響。研究結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程控制pH在4.0左右，不僅可以抑制ε-PL分解酶活性，同時(shí)使得底物葡萄糖更多地用于ATP和ε-PL合成，從而有利于ε-PL的積累；另外，維持菌體比生長(zhǎng)速率在合理區(qū)間(0.06 h-1左右)，也是獲得ε-PL高效積累的重要控制條件。因此，在發(fā)酵過(guò)程中將pH控制在較低水平，不僅能夠抑制分解酶活性、提高胞內(nèi)ATP濃度，還可以將菌體生長(zhǎng)控制在合適的速率范圍，最終共同調(diào)控了ε-PL大量積累。基于上述發(fā)現(xiàn)，在ε-PL補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中(pH沖擊模式)，當(dāng)菌體增長(zhǎng)緩慢時(shí)，可通過(guò)流加有機(jī)氮源(如酵母粉)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)；而當(dāng)菌體增長(zhǎng)過(guò)快，可通過(guò)適當(dāng)下調(diào)pH，以維持細(xì)胞比生長(zhǎng)速率在0.06 h-1左右，進(jìn)一步達(dá)到高產(chǎn)ε-PL的目的。