湯文晶，李松，馬忠寶，楊倩，湯斌

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

半纖維素(hemicellulose)是植物細(xì)胞壁主要組分之一，由甘露聚糖、木聚糖及少量半乳聚糖和阿拉伯聚糖組成[1]。半纖維素的有效水解，對(duì)改善木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)、提高資源利用率、制備功能性寡糖等具有重要意義[2]。

β-甘露聚糖酶(β-mannanase; EC3.2.1.78)是半纖維素酶的一種，可催化水解β-1,4甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖分子中的β-1,4甘露糖苷鍵，以釋放甘露糖或制備功能性甘露低聚糖[3]，因而被廣泛應(yīng)用于飼料、造紙、食品和木質(zhì)纖維素燃料乙醇等行業(yè)[4-6]。自然界β-甘露聚糖酶主要來源于微生物，包括曲霉屬(Aspergillussp.)[7]、青霉屬(Penicilliumsp.)[8]、木霉屬(Trichodermasp.)[9]等絲狀真菌以及芽孢桿菌屬(Bacillus)[10-11]和放線菌屬(Actinomyces)[12-13]等細(xì)菌。真菌甘露聚糖酶作用pH值范圍一般為酸性至中性，細(xì)菌甘露聚糖酶多為中性至堿性。其中，堿性β-甘露聚糖酶因在堿性條件下具有較好的耐受性和催化活力，從而在造紙[14]、苧麻脫膠[15]、洗滌[2]和石油開采[16]等特殊行業(yè)中具有廣泛應(yīng)用前景。

本文從不同土樣中篩選得到多株產(chǎn)β-甘露聚糖酶堿性細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定和搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化，為進(jìn)一步實(shí)施β-甘露聚糖酶基因克隆、異源表達(dá)和放大發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

從蕪湖市神山公園、濱江公園、鏡湖湖邊等土壤中篩選分離得到多株堿性細(xì)菌并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，pH 6.8。

堿性細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO41，瓊脂20，pH 9.0。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO41，魔芋粉3，瓊脂20，pH 9.0。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，KH2PO41，pH 9.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉10，酵母粉8，NaCl 5，KH2PO41，MgSO40.1，pH 9.0。

所有堿性培養(yǎng)基均使用Na2CO3調(diào)節(jié)pH，培養(yǎng)基配制完成后于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

麥芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、甘露糖等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；魔芋粉(食品級(jí))，當(dāng)?shù)爻校籘-載體、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶，寶生物工程(大連)有限公司；16S rDNA PCR擴(kuò)增通用引物(27F和1492R)，上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TC312 PCR儀，美國TECH公司；EC3I UVP凝膠成系統(tǒng)，美國UVP公司；64R高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman-Coulter公司；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；723可見分光光度計(jì)，上海菁華科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

堿性細(xì)菌初篩：分別稱取0.1 g土樣置于1.5 mL離心管，加入1 mL無菌水后充分振蕩混勻，靜置10 min吸取100 μL上層液涂布于到堿性細(xì)菌篩選培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)約24 h。

產(chǎn)β-甘露聚糖酶細(xì)菌篩選：將篩選所得堿性細(xì)菌分別點(diǎn)種至初篩培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后加入5 mL稀碘液(碘3 g/L+碘化鉀6 g/L)，染色5 min后傾去稀碘液并通過測(cè)量D/d值(透明圈直徑/菌落直徑)，選取D/d值較大菌株進(jìn)行純化和后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 形態(tài)特征及大分子水解實(shí)驗(yàn)

篩選菌株顯微觀察和大分子水解等實(shí)驗(yàn)參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[17]所述方法和步驟進(jìn)行。

1.3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌染色體DNA的提取、質(zhì)粒DNA小量制備及DNA連接、轉(zhuǎn)化等分子操作按文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。以染色體DNA為模板，以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1429R(5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′)為上下游引物，在54 ℃退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接入T-載體，提取重組質(zhì)粒并送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)定。通過在線數(shù)據(jù)庫Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)對(duì)測(cè)定序列進(jìn)行比對(duì)，選擇同源性較高的序列利用BioEdit軟件進(jìn)行ClustalW多重比對(duì)(重復(fù)計(jì)算1 000次)，并進(jìn)一步使用MEGA 5.0軟件通過Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

搖瓶發(fā)酵條件：挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基30 mL/250 mL，于37 ℃、200 r/min下培養(yǎng)16 h，按3%比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL/250 mL并于37 ℃、200 r/min下發(fā)酵36 h，測(cè)定β-甘露聚糖酶活力。

生長過程曲線繪制：將分離菌株分別接種至pH 9.0和pH 10.0種子培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)。定期取樣測(cè)定培養(yǎng)液細(xì)胞密度(OD600)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度OD600為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長過程曲線。

粗酶最適反應(yīng)pH和溫度測(cè)定：在上述酶活力測(cè)定條件下，分別將緩沖液pH調(diào)整為8.5、9.0、9.5、10.0和10.5，以研究pH值對(duì)酶催化活力的影響；分別將反應(yīng)溫度調(diào)整為35、40、45、50和55 ℃，以研究溫度對(duì)酶催化活力的影響。分別以不同pH或溫度測(cè)定條件下所獲得的最高酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，以確定酶的最適反應(yīng)pH和溫度。

綜合篩選菌株對(duì)堿性pH的耐受性、酶的最適作用溫度和pH等特性，擇優(yōu)選擇菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.5 β-甘露聚糖酶活力測(cè)定

取0.6 mL 5 g/L魔芋粉水溶液與0.6 mL甘氨酸-NaOH緩沖液(0.2 mol/L，pH 9.0)混合，于40 ℃預(yù)熱5 min后加入稀釋酶液0.2 mL，于40 ℃反應(yīng)30 min并利用DNS試劑顯示法[19]測(cè)定還原糖生成量，還原糖濃度以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算。以滅活(90 ℃保溫20 min)酶液為空白對(duì)照，計(jì)算酶活力。酶活定義：在上述測(cè)定條件下，每分鐘生成1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.6 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素優(yōu)化：在1.3.4所述搖瓶發(fā)酵條件中，分別將碳源(10 g/L)調(diào)整為可溶性淀粉、糊精、玉米淀粉、麥芽糖，研究不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；將氮源(8 g/L)調(diào)整為蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NH4NO3，研究不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響；將發(fā)酵液初始pH調(diào)節(jié)至8.5～10.5，研究pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響；使用10%～50%的裝液量，研究不同裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，分別選取魔芋粉、酵母粉、無機(jī)離子和pH等4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩及形態(tài)學(xué)觀察

經(jīng)初篩共獲得20株堿性細(xì)菌，進(jìn)一步復(fù)篩得到8株在含有魔芋粉培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生透明圈的菌株。其中，編號(hào)為AM1、AM3和AM7的3株菌D/d值較大，如圖1-a所示。

經(jīng)劃線分離觀察菌落形態(tài)可知，菌株AM1單菌落呈圓形，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，中間凸起；菌株AG3菌落呈圓形，深黃色，表面光滑，邊緣整齊，中間凸起；菌株AG7單菌落呈圓形，淡黃色，表面光滑，邊緣整齊。掃描電鏡結(jié)果表明，3個(gè)菌株的形態(tài)較為相似，均為短桿狀，長2～3 μm，寬約0.5 μm，如圖1-b～d所示。其中，菌株AM1和AM3菌體較為飽滿且兩端呈明顯的橢圓狀。

a-菌落透明圈；b- AM1；c- AM3；d- AM7圖1 3株堿性細(xì)菌在初篩培養(yǎng)基中經(jīng)染色后產(chǎn)生的透明圈照片(a)及菌體細(xì)胞5 000倍SEM顯微照片(b～d)Fig.1 Picture of transparent circle formed after staining(a) and 5 000-fold SEM micrograph for the three isolated alkaline bacteria cells (b-d)

大分子水解實(shí)驗(yàn)研究表明，3個(gè)菌株對(duì)羧甲基纖維素鈉、木聚糖和可溶性淀粉等大分子底物均具有水解作用，但都不能水解油脂，如表1所示。

表1 3株堿性細(xì)菌大分子水解實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of hydrolysis of macromol- ecule by the three isolated alkaline bacteria

注：“+”號(hào)表示菌株對(duì)底物的水解程度；“-”號(hào)表示菌株對(duì)底物無水解能力。

2.2 菌株復(fù)篩

生長過程曲線研究表明，菌株AM1、AM3和AM7在pH 9.0條件下發(fā)酵12 h后細(xì)胞密度(OD600)分別達(dá)到3.69、2.49和2.62；在pH 10.0條件下最高OD600分別為2.02、1.79和2.08，如圖2所示。

圖2 3株堿性細(xì)菌分別在pH 9.0和pH 10.0條件下的生長過程曲線Fig.2 Growth curve of the three isolated alkaline bacteria which were cultivated under pH 9.0 and pH 10.0,respectively

發(fā)酵36 h后，菌株AM1、AM3和AM7發(fā)酵液中甘露聚糖酶活力分別為80、36和19 U/L。粗酶性質(zhì)研究表明，菌株AM1、AM3和AM7所產(chǎn)甘露聚糖酶最適作用溫度均在50 ℃左右(圖3-a)，最適作用pH分別為9.5、9.5和9.0(圖3-b)。因此，綜合各菌株生長、產(chǎn)酶及酶性質(zhì)等特點(diǎn)，選擇相對(duì)較優(yōu)菌株AM1作為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 三株堿性細(xì)菌所產(chǎn)甘露聚糖酶的最適作用溫度(a)和pH(b)Fig.3 The optimum temperature (a) and pH (b) of mann-anase produced by the three isolated alkaline bacteria

2.3 分子生物學(xué)鑒定

以菌株AM1染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得16S rDNA大小約為1.6 kb，如圖4-a所示。經(jīng)測(cè)序、同源比對(duì)(Blastn)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，菌株AM1與芽孢桿菌屬(Bacillus)同源性較高，在鑒定到種的菌株中與一株科氏芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(B.cohniiDSM 6307)染色體中15個(gè)區(qū)域(range)序列平均同源性最高(GenBank登錄號(hào)：CP018866.1；Identity：96.54%)，且與B.cohnii處于同一發(fā)育地位，如圖4-b所示。

a- PCR產(chǎn)物凝膠電泳;b-菌株AM1 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹;1-以基因組DNA為模板擴(kuò)增結(jié)果；2-以重組T-載體為模板擴(kuò)增結(jié)果；M-DNA分子標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照?qǐng)D4 菌株AM1 16S rDNA PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.4 Gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products for strain AM1

因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將AM1鑒定為一株科氏芽孢桿菌，并命名為科氏芽孢桿菌AM1(B.cohniiAM1)。

2.4 單因素試驗(yàn)

單一碳源產(chǎn)酶研究表明，菌株AM1利用魔芋粉發(fā)酵產(chǎn)酶水平最高，顯著高于其他碳源(圖5-a)，可能因?yàn)槟в蠓鄄粌H可以作為碳源使用，還對(duì)甘露聚糖酶的表達(dá)具有底物誘導(dǎo)作用；單一氮源研究表明，利用酵母粉所得產(chǎn)酶水平最高(圖5-b)。同時(shí)，菌株AM1分別在pH 9.5和裝液量為30%(75 mL/250 mL)條件下獲得發(fā)酵產(chǎn)酶水平最高，分別如圖5-c和圖5-d所示。

圖5 不同碳源(a)、氮源(b)、pH(c)和裝液量(d)對(duì)菌株AM1發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶的影響Fig.5 Effect of different carbon sources (a), nitrogen sources(b), pH values (c) and loading volumes (d) on the production of mannanase by strain AM1

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化

為綜合考察多種因素對(duì)菌株AM1發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶的影響，進(jìn)一步選取魔芋粉、酵母粉、無機(jī)離子和pH等4因素進(jìn)行3水平正交優(yōu)化試驗(yàn)。選擇L9(34)正交表進(jìn)行水平組合處理設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析如表2所示。

表2 菌株AM1發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test of mannanase production by strain AM1

結(jié)果表明在所設(shè)定試驗(yàn)條件下，各因素影響產(chǎn)酶水平主次順序?yàn)椋篈>B>C>D，即魔芋粉>酵母粉>無機(jī)離子種類>初始pH；產(chǎn)甘露聚糖酶優(yōu)選發(fā)酵條件為A2B3C1D2，即(g/L)：魔芋粉6，酵母粉15，MgSO40.1，初始pH 9.5時(shí)，最高酶活力達(dá)到345 U/L，為優(yōu)化前產(chǎn)酶水平的4.3倍。

3 結(jié)論與討論

本文通過自然篩選方式，從不同土樣中篩選得到20株堿性細(xì)菌并獲得3株具有堿性β-甘露聚糖酶分泌能力菌株，進(jìn)而對(duì)其中1株產(chǎn)酶水平較高且性質(zhì)相對(duì)較好的菌株AM1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究。結(jié)合同源序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將菌株AM1鑒定為1株科氏芽孢桿菌(B.cohnii)，其在pH 9.0條件下生長較好，所產(chǎn)β-甘露聚糖酶具有較高最適作用溫度(55 ℃)和pH(9.5)，與多數(shù)細(xì)菌甘露聚糖酶最適作用pH(中性至堿性)[2]相比，菌株AM1所產(chǎn)甘露聚糖酶最適作用pH相對(duì)較高，且在pH 9.0～9.5范圍內(nèi)具有較大催化活力(>80%)，在堿性加工工藝中可能更具有應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。優(yōu)化得到發(fā)酵培養(yǎng)條件為：魔芋粉6 g/L，酵母粉15 g/L，MgSO40.1 g/L，初始pH為9.5，裝液量為30%，所得β-甘露聚糖酶發(fā)酵水平達(dá)到345 U/L。研究結(jié)果可為堿性β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌株的篩選和放大發(fā)酵培養(yǎng)提供參考，為后期堿性β-甘露聚糖酶編碼基因的克隆及異源表達(dá)等相關(guān)研究提供良好的菌種資源。